三七总皂苷对成年地鼠视网膜节细胞存活的阻碍

阻碍

魏莉娜， 朱永红， 李海标

【摘要】 【目的】 探讨玻璃体注射三七总皂苷(tPNS)对视神经切断后视网膜节细胞(RGCs)存活的作用。【方式】 用荧光素逆行示踪标记法和定量解剖学技术观看正常和经tPNS处置的金黄地鼠于视神经切断后五、7、14 d时RGCs的密度。动物分为正常组、单纯切断视神经组（未注射组）、tPNS处置组和生理盐水对照组。【结果】正常RGCs平均密度为(1970 ± 82)/mm2;视神经切断后五、7、14 d时RGCs平均密度别离下降至(983 ± 48)/ mm二、(788 ± 44)/ mm2和(216 ± 37)/ mm2; 生理盐水对照组在各时刻点RGCs平均密度与未注射组结果相似; tPNS处置组结果别离为(1363 ± 56)/ mm二、(1169 ± 70)/ mm2和(477 ± 25)/ mm2,与未注射组和生理盐水对照组相较在各时刻点上均存在显著性不同(P< 。【结论】 玻璃体注射tPNS可提高成年地鼠视神经切断后RGCs的短时间存活率。

【关键词】 三七总皂苷; 视网膜节细胞; 细胞存活; 成年地鼠

Abstract：【Objective】 To investigate the effects of tPNS on the survival of axotomized RGCs by intravitreal injection.

【Methods】 Fluorescent retrograde tracing method and quantitative anatomical techniques were used to measure the densities of RGCs in all groups of adult hamsters. Animals were separated into 4 groups, which were normal, ON axotomied only (no injection), treated with tPNS, and treated with sodium saline.【Results】 In normal retinas, the mean densities of RGCs were (1970 ± 82)/mm2. At the 5th, 7th, and 14th day after axotomy, the mean densities of RGCs decreased to (983 ± 48)/ mm2, (788 ± 44)/ mm2， and (216 ± 37)/ mm2, respectively. In the group treated with sodium saline, the results were similar to those observed in the no injection group. In the tPNS group, the results were (1363 ± 56)/ mm2, (1169 ± 70)/ mm2， and (477 ± 25)/ mm2, respectively, which were different from the no injection group or the sodium saline group (P< . 【Conclusions】 tPNS could improve the survival of RGCs during short term after axotomy in adult hamsters.

Key words: total panax notoginseng saponins; retinal ganglion cells; cell survival; adult hamsters

近端切断成年哺乳动物视网膜节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)的轴突，神经元在短时间内大量死亡，其缘故可能为：细胞内

Ca2+超载和自由基的损害；靶源性神经营养因子的缺乏；一氧化氮和兴奋性氨基酸的毒性作用。研究说明，近端切断成年哺乳动物视神经后，单一或联合给予Ca2+通道阻断剂、自由基清除剂、神经营养因子、一氧化氮合酶抑制剂或谷氨酸受体拮抗剂均能在不同程度上提高RGCs的存活率[1-5]。但神经营养因子价钱昂贵且只能局部应用，Ca2+通道阻断剂和谷氨酸受体拮抗剂引发的全身副反映大，应用受限。寻求有效的中药医治是目前研究者们关注的课题。三七总皂苷(total panax notoginseng saponins, tPNS)是五加科人参属植物三七的要紧有效成份,是一种受体操纵Ca2+通道阻断剂，具有扩张血管、清除自由基、抗炎、抗氧化等药理作用[6-8]。研究说明，腹腔注射tPNS对轴突损伤后RGCs的存活有增进作用[9]。本实验拟研究玻璃体注射tPNS对轴突损伤后RGCs存活的阻碍。

1 材料与方式

实验动物及分组

健康成年金黄地鼠60只, 雄性，体质量80~100 g,中山大学北校区实验动物中心提供。动物随机分为4组(n=6):正常组、单纯切断视神经组（未注射组）、tPNS处置组和生理盐水对照组。后3组按视神经切断后视网膜取材的时刻再分为5 d、7 d、14 d的3个时刻组。

要紧试剂及仪器

tPNS（广西梧州制药集团股分）,为浅黄色粉末,溶于生理盐水配成200 g/L,保留于－20 ℃。快蓝(fast blue，FB.德国Merck公司),用生理盐水配制为30 g/L 的浓度,4 ℃冰箱避光保留。XTS-4C手术显微镜(镇江光学仪器厂),DMIRB荧光显微镜(Olympus)。

手术方式

玻璃体注射2 μL不同浓度的tPNS或生理盐水后30 min, 距球后 mm处剪断视神经, 复位眼球。在7 d的实验组，再次注射时刻为 5 d；在14 d的实验组，补充注射时刻为4、7、10 d。玻璃体注射2 μL浓度别离为50、100、150、200 g/L的tPNS，观看其对视神经切断后7 d时RGCs存活的作用，以获取最正确浓度。

RGCs的标记与计数

正常组动物于视神经切断后当即在近侧残端放置沾有FB的明胶海棉，2 d后取材。其余组于取材前2 d再次暴露视神经，快要侧残端剪短至 mm,同上标记。

取材时在致死量麻醉状态下掏出眼球，置于40 g/L多聚甲醛

mol/L磷酸缓冲液,pH=中剥离视网膜，4 ℃固定1~3 h,依照文献制备视网膜平铺片[10]。荧光显微镜下观看并拍照视网膜平铺片上FB标记的RGCs,拍照视野的选择方式参照文献[11],即以视乳头为中心,在通过视乳头的坐标轴上,别离从视网膜鼻上、鼻下、颞上、颞劣等距取点,每一个视网膜共取24~32个点,用Photoshop 在 mm2方框中计数细胞，重复两次求平均值。所有数据以均值±标准差（ｘ±ｓ）表示，采纳SPSS 软件单因素方差分析，查验水准 α=。

2 结 果

正常RGCs密度

经视神经残端标记的正常RGCs平均密度为(1970 ± 82)/mm2(图1)。细胞胞体为圆形或卵圆形,逆行标记的荧光物质要紧散布在神经元的核周质和树突起始部(图1:A)。标记的RGCs在视网膜平铺片上散在散布，且从视乳头中心区到外周区呈现递减趋势(图1B～D)。

视神经切断后存活RGCs的密度

视神经近端切断后,短时间内RGCs大量死亡,其密度明显下降,切断后五、7、14 d时RGCs平均密度别离下降至(983 ± 48)/ mm二、

(788 ± 44)/ mm2和(216 ± 37)/ mm2，与正常RGCs密度相较，其存活率别离为50%、40%和11% 。 tPNS量效分析

从表1可见, tPNS在50 ~150 g/L时,随浓度增加RGCs密度也增加,当浓度为200 g/L时，RGCs密度未见上升。但tPNS处置组与对照组相较RGCs密度均增加(P< 。当浓度为150 g/L时RGCs存活达到峰值,故以150 g/L为最正确浓度。

tPNS对RGCs存活的阻碍

经tPNS处置的动物,切断视神经后5 d、7 d、14 d时的存活RGCs平均密度见表2,与正常RGCs密度相较,其存活率别离为69%、59%和24%。与未注射组相较，五、7 d的RGCs存活率均增加了19%，14 d的存活率增加了13%。生理盐水对照组结果与未注射组结果相近。经单因素方差分析, tPNS组与未注射组和生理盐水对照组相较在视神经切断后不同时刻点均有统计学意义(P< 。

3 讨 论

本实验所得正常RGCs平均密度为(1970 ± 82)/mm2，视神经切断后五、7、14 d时RGCs存活率别离为50%、40%、11% ，结果与以往的报导大体相似[11]。端切断成年哺乳动物的视神经可致使RGCs在短

时间内大量死亡[1]，探讨RGCs死亡缘故并提出有效的防治方法是神经生物学研究的重要课题。Ca2＋是神经细胞内重要的信息物质，大量研究说明，胞内Ca2＋超载可致使神经元的死亡，而降低胞内Ca2＋浓度的方法可增进受损神经元的存活[5,12]。

近来有研究提示，中药对中枢神经系统受损神经元的存活有爱惜作用[13,14]，其中传统中药三七的神经爱惜作用很受关注[15-17]。tPNS是五加科人参属植物三七的要紧有效成份,是一种受体操纵Ca2+通道阻断剂,具有扩张血管，清除自由基,抗炎,抗氧化等药理作用[6-8]。本课题组以往的研究说明，腹腔注射tPNS能够增进视神经切断后RGCs的存活，5 d、7 d、14 d时RGCs存活率别离提高了13%、12%、5% [9]。但腹腔注射的tPNS通过血液循环抵达损伤局部才能发挥作用，阻碍因素较多，无益于对其机制的探讨。本实验选择玻璃体腔内局部注射的方式，便于tPNS直接作用于受损RGCs，促使其有效发挥爱惜作用,也便于以后对其作用机制的研究。

本实验结果说明玻璃体注射tPNS对视神经切断后RGCs的存活有爱惜作用。与未注射组相较，在视神经切断后五、7、14 d的节细胞存活率别离提高了19%、19%、 13%。其作用在切断后5 d、7 d较14 d时显著。与腹腔注射tPNS对RGCs存活的作用相较，玻璃体注射tPNS在各个时刻点均有优势。

本实验结果还说明，tPNS对受损RGCs的爱惜作用呈现剂量依托性，有最正确作用浓度，与人参皂苷有相似性[13]。这可能与其抑制Ca2+内流的机制有关，因为只有适合的胞内Ca2+浓度才能对细胞的生存起增进作用，但确切机制尚需进一步研究。在视神经切断后两周内，tPNS提高受损RGCs存活率的成效显著，提示其短时间内对受损神经元有爱惜作用，其长期作用情形将在下一步实验中进行探讨。

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