综合实验之生物制品分析检测

实验一:斐林试剂置换法测定还原糖的含量

一、 实验原理:

糖类包括多糖、双糖和单糖，其中单糖和某些双糖具有游离的羰基，称为还原糖，多糖和蔗糖无还原性。利用糖的还原性，与斐林试剂（氧化剂）中的二价铜离子还原为一价铜，进行氧化还原反应，而进行测定.非还原糖必须转化为还原糖，再进行测定。

斐林试剂中酒石酸钾钠铜是一种氧化剂，反应的终点可用次甲基蓝作指示剂，在碱性、沸腾环境下还原呈无色。根据斐林试剂完全还原所需的还原糖量，计算出样品还原糖量。 二、 试剂与材料： 1、试剂：

菲林试剂甲液：称取69.3g硫酸铜晶体，用蒸馏水溶解，定容至1000ml

菲林试剂乙液：称取346g酒石酸钾钠，100g氢氧化钠，用蒸馏水溶解定容至1000ml 2、1%次甲基蓝溶液：1g次甲基蓝溶于100ml水

3、0.2%标准葡萄糖溶液：2g葡萄糖105℃烘干到恒重加水到1000ml 4、碱式滴定管

5、样品溶液：待测葡萄糖溶液

样品1：稀释20倍，样品2：稀释50倍 6、电炉

三、操作方法： 1、斐林试剂标定

A 取甲液5ml+乙液5ml，（注意：甲液与乙液混合可生成氧化亚铜沉淀，应将甲液加入乙液，使开始生成的氧化亚铜沉淀重溶）置于250ml三角瓶中，加入10ml水，并从滴定管中加入0.2%的标准葡萄糖溶液若干毫升（约23ml） 。（量控制在后滴定时消耗葡萄糖液在0.5－1.0ml)

B 电炉上加热至沸，并保持微沸2分钟，加2滴1%次甲基蓝溶液，趁沸以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液用0.2%标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，有红棕色沉淀，溶液清亮为终点止。记录耗用的葡萄糖液量为V0,必须在1min内完成。

注意：还原的次甲基蓝易被空气中的氧氧化，恢复成原来的蓝色，所以滴定过程中必须保持溶液成沸腾状态，并且避免滴定时间过长。 2、定糖预备试验

同1法取斐林试剂，加10ml样品液，摇匀于电炉上加热至沸，保持微沸2分钟，加2滴1%次甲基蓝，用0.2%葡萄糖液滴定至蓝色消失。记录耗用的葡萄糖液量为V1 3、样品中还原糖测定

同上法吸取斐林试剂加10ml样品液(预先稀释)，补加（V0—V1）ml水，并从滴定管中预先加入（V1—1）ml 0.2%葡萄糖液，摇匀至电炉上加热至沸，保持2min微沸，加入2滴1%次甲基蓝，继续用葡萄糖液滴定至蓝色消失。记录消耗的标准葡萄糖液体积为V毫升。 四、结果计算

还原糖含量(以葡萄糖液计) =（Vo-V) *0.002 *1/10 * n（ g/ml) 式中Vo-------- 斐林试剂标定值，ml V--------- 样品糖液测定值，ml 0.002----- 标准GS液浓度，g/ml 10-------- 样品糖液体积，ml

n--------- 样品稀释倍数

实验二：凯氏定氮法测定蛋白质的含量

一、原理：有机含氮化合物与浓硫酸共热消化，氮转化为氨，再与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵与强碱反应，放出氨。将氨蒸馏到过量的标准无机溶液中，再用标准碱溶液进行滴定。根据测得的氨量，计算样品的总氮量。 二、试剂与材料：

浓硫酸、硫酸钾－硫酸铜粉末（称取80g硫酸钾和20g硫酸铜结晶体，0.3g二氧化硒研细混合）、30％氢氧化钠溶液、2％硼酸溶液、0.01M标准盐酸、混合指示剂（田氏指示剂）储存液（取50ml 0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200ml 0.1％甲基红溶液混合，储存于棕色瓶中备用。此指示剂在PH5.2为紫色；PH为5.4为暗灰色或灰色；PH5.6为绿色；变色点为PH5.4）、硼酸－田氏指示剂混合液（100ml 2％硼酸溶液，滴加约1ml田氏指示剂，摇匀后，溶液呈紫红色）、蛋白质样品、容量瓶、吸管、凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、微量滴定管、电炉 浓硫酸500ml、硫酸钾200g、硫酸铜200g、硼酸50g、盐酸200ml、甲基红0.5g、溴甲酚绿 0.5g

三、操作方法

1、样品处理：固体样品，应在105℃干燥至恒重。液体样品可直接吸取一定量，也可经适当稀释后，吸取一定量进行测定，使每一样品的含氮量在0.2－1.0mg范围内。

2、消化：取一定量样品，于50ml干燥的凯氏烧瓶内。加入300mg硫酸钾－硫酸铜混合粉末，再加入3ml浓硫酸。用电炉加热，在通风厨中消化，瓶口加一小漏斗。先以文火加热，避免泡沫飞溅，不能让泡沫上升到瓶颈，待泡沫停止发生后，加强火保持瓶内液体沸腾。时常转动烧瓶使样品全部消化完全，直至消化液清澈透明。

另取凯氏瓶一个，不加样品，其它操作相同，作为空白试验，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，以对样品进行校正。

3、蒸馏：将微量凯氏蒸馏装置洗涤（先用水蒸气洗涤）干净。将凯氏烧瓶中的消化液冷却后，全部转入100ml的容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。

吸取20ml稀释消化液，置于蒸馏装置的反应室中，加入10ml30％氢氧化钠溶液，将玻璃塞塞紧，于漏斗中加一些蒸馏水，作为水封。

取一三角瓶，加入10ml硼酸－田氏指示剂混合液，置于冷凝管之下口，冷凝管口应浸没在硼酸液面之下，以保证氨的吸收。

加热水蒸汽发生器，沸腾后，夹紧夹子，凯氏蒸馏。三角瓶中的硼酸－指示剂混合液，吸收蒸馏出的氨，由紫红色变为绿色。蒸馏15min，让硼酸液面离开冷凝管口，再蒸1－2min以冲洗冷凝管口。空白试验按同样操作进行。

4、滴定：样品和空白均蒸馏完毕后，用0.01M标准盐酸滴定，至硼酸－指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。

四、计算 样品总氮量（mg）=（A-B）×c×14×100/20

式中：A：样品滴定时消耗的标准盐酸体积 B：空白滴定时消耗的盐酸体积 C：标准盐酸的当量浓度 14：氮的相对分子量 20：用于蒸馏的稀释消化液体积 100：稀释消化液的体积

样品中粗蛋白含量（mg）＝样品总氮量（mg）×6.25

实验三：麦芽水分测定 材料与仪器：

深色麦芽；浅色麦芽；各种分析天平；干燥器；称量皿

实验方法与步骤：

1、麦芽粉的制备

按取样法先取少量样品倒入粉碎机中，用以洗涤粉碎机，然后倒入样品进行粉碎，使用60目筛过筛，使细粉含量达90%以上。如表皮不能一次磨成细粉，需反复粉碎，直至达到要求。供分析麦芽水分含量、麦芽糖化力测定使用等。 2、直接干燥法测定麦芽水分含量： （1）步骤：

① 称取粉碎麦芽约5g，称量准确至0.001g，放入已称至恒重的称重皿中，弄平立即盖好，操作愈迅速愈好。

② 称重皿置干燥箱中，将盖取下，在105～107℃下干燥3h。

③ 趁热将称重皿盖好，取出，置干燥器中冷却半小时后称重。再重复烘半小时，冷却称重到恒重（如两次称重相差在2mg以内，即作为恒重）。 ④ 记录下列数据。 称重皿质量 /m0（g） （2）结果计算：

样品和称重皿质量 /m1（g） 烘干后样品和称重皿质量/m2（g） #1 #2 #3 恒重值 Xm1m2100

m1m0式中：X——样品中水分的质量分数，%；

m0——称量皿的质量，g； m1——称量皿和样品的质量，g；

m2——称量皿和样品干燥恒重后的质量，g。

实验四：碘量法测定麦芽糖化力 材料与仪器：

0.1mol/L硫代硫酸钠溶；乙酸一乙酸钠缓冲溶液；1mol/L氢氧化钠溶液；1mol/L硫酸溶液；0.1mol/L碘溶液；2%可溶性淀粉溶液；蒸馏水

恒温水浴锅及电动搅拌器；搪瓷杯或硬质烧杯；200 mL容量瓶；250mL碘量瓶；糖化杯；双层干燥纸

实验方法与步骤：

（一）样品处理

1、测糖化力试剂：

① 硫代硫酸钠标准溶液：（0.1mol/L）

称12.5g Na2S2O3·5H2O于250mL烧杯中，用新煮沸且已放冷的蒸馏水溶解后，移入500mL棕色瓶中，加入0.1g Na2CO3，用上述蒸馏水稀释至500mL，摇匀，放暗处7～14天后，按GB601配制与标定。 ② PH4.3乙酸一乙酸钠缓冲溶液：

称取30g分析纯乙酸用蒸馏水稀释至1000mL，另称取34g分析纯乙酸钠（CH3COONa·3H20）溶于蒸馏水中并稀释至500mL。将两溶液混合，其PH为4.3±0.1。

③ 氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取40g氢氧化钠，用水溶解至1000mL。

④ 硫酸溶液（1mol/L）：量取28ml浓硫酸，缓缓倒入适量水中并衡释至1000mL，冷却，摇匀。

⑤ 碘溶液（0.1mol/L）：称取13g碘及35g碘化钾，溶于100mL水中并稀至1000mL，摇匀，保存于棕色具塞瓶中。

⑥2%可溶性淀粉溶液：称取2g可溶性淀粉，加少量蒸馏水调成糊状，倾入100mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却。 2、协定法麦芽汁的制备：

（1）称取粉碎麦芽样50.0g放入已知质量的糖化杯中，加入200mL蒸馏水（一般为46～47℃），使混合后恰好达到45℃保温30min。

（2）以每分钟升温1℃的速度升温，在25min内升至70℃，此时于杯内加入100mL70℃水。

（3）在70℃保温1h后冲洗搅拌器，取出糖化杯，在10～15min内急速冷却到室温。 （4）擦干杯处壁水分，补加水准确使其内容物质量为450g。

（5）搅拌均匀后，以双层干燥纸过滤，最初滤出的100mL滤液反回重滤，重滤后的溶液为协定法麦汁。 3、麦芽渗出液的制备

（1）称取粉碎麦芽样20.00g，（深色麦芽为40.00g）置于已知质量的搪瓷杯或硬质烧杯

中，加蒸馏水480mL。

（2）于40℃水浴中，在40℃恒温下搅拌1h（搅拌机转速为1000转/分）。

（3）取出渗出杯，冷却至室温，补充水使其内容物质量为520.0g（深色麦芽为540.0g）。 （4）搅拌均匀后，以双层干燥滤纸过滤，弃去最初滤出的100mL滤液，返回重滤，重滤后，滤液为麦芽渗出液,供分析糖化力用样。 4、麦芽糖化液的制备

量取2%可溶性淀粉溶液100mL，置于200mL容量瓶中，加10mL乙酸一乙酸钠缓冲溶液，摇匀，在20℃水浴中保温20min。准确加入5.00mL麦芽浸出液，摇匀，在20℃水浴中准确保温30min，立即加入1mol/L氢氧化钠溶液4mL，振荡，以终止酶的活动，用水定容至刻度。

（二）操作步骤： ①空白试验的制备

量取2%可溶性淀粉溶液100mL，置于200mL容量瓶中，在20℃水浴中保温20min后，加入1mol/L氢氧化钠溶液2.35mL，摇匀，加5.00mL麦芽浸出液，用水定容至刻度。 ②碘量法定糖

吸取麦芽糖化液和空白试验液各50.00mL，分别置入250mL碘量瓶中，各加入0.1mol/L碘溶液25.00 mL，1mol/L氢氧化钠溶液3mL摇匀，盖好，静置15min。加1mol/L硫酸溶液4.5mL，立即用0.1mol/L硫代硫酸钠溶滴定至蓝色失为终点。

③实验记录表 项目 次数 取样毫升数/mL 滴定耗Na2S2O3毫升数/mL 平均值/mL （2）结果计算：

麦芽糖化力是以100g无水麦芽在20℃、pH4.3条件下分解可溶性淀粉30min产生1g麦芽糖为1个维柯（WK）糖化力单位

V= 1 糖化液 2 3 1 V0= 空白液 2 3 WK麦芽糖化力V0VC34.2100

1M式中 V0——空白液消耗Na2S2O3标准溶液的毫升数，mL;

V——麦芽糖化液消耗Na2S2O3标准溶液的毫升数，mL； C——Na2S2O3标准溶液的摩尔浓度，mol/L； M——麦芽水分百分含量，%；

34.2——换算系数；（20g麦芽样的转换系数，浓色麦芽应将34.2改为17.1）

五、实验结果分析 六、注意事项

1. 麦芽渗出液保存不应超过6h；

2. 麦芽糖化液的制备中，加氢氧化钠溶液后溶液应呈碱性，pH为9.4～10.6，可用pH试纸检验；

3. 本实验中用Na2S2O3标准溶液的制备、标定及注意问题参考分析化学有关部份。