第二部分毒理试验方法

第二部分 毒理学试验方法

Methods of Toxicological Test

一、总则

General Principles

1 范围

本规范规定了化妆品原料及其产品安全性评价的毒理学检测要求。 2 化妆品原料的检测

化妆品的新原料，一般需进行下列毒理学试验： （1）急性经口和急性经皮毒性试验； （2 ）皮肤和急性眼刺激性/腐蚀性试验； （3 ）皮肤变态反应试验；

（4 ）皮肤光毒性和光敏感试验* （原料具有紫外线吸收特性需做该项试验）； （5 ）致突变试验（至少应包括一项基因突变试验和一项染色体畸变试验）； （6 ）亚慢性经口和经皮毒性试验； （7 ）致畸试验；

（8 ）慢性毒性/致癌性结合试验； （9 ）毒物代谢及动力学试验*；

（10）根据原料的特性和用途，还可考虑其它必要的试验。

如果该新原料与已用于化妆品的原料化学结构及特性相似，则可考虑减少某些试验。 *试验方法参照GB7919-87 化妆品安全性评价程序和方法；

OECD 化学物质试验指南(OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 。

3 化妆品产品的检测 3.1 检测项目

在一般情况下，新开发的化妆品产品在投放市场前,应根据产品的用途和类别进行相应 的试验，以评价其安全性。 3.2 检测项目的选择原则

3.2.1 由于化妆品种类繁多，在选择试验项目时应根据实际情况确定。

3.2.2 每天使用的化妆品需进行多次皮肤刺激性试验，进行多次皮肤刺激性试验者不再进行 急性皮肤刺激性试验，间隔数日使用的和用后冲洗的化妆品进行急性皮肤刺激性试验。 3.2.3 与眼接触可能性小的产品不需进行急性眼刺激性试验。

二、急性经口毒性试验

Acute Oral Toxicity Test 1 范围

本规范规定了动物急性经口毒性试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于化妆品原料安全性毒理学检测。 2 规范性引用文件

OECD Guidelines for Testing of Chemicals （No. 401, Feb. 1987 ）

USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines （Series 870.1100, Aug. 1998 ） 3 试验目的

急性经口毒性试验是评估化妆品原料毒性特性的第一步，通过短时间经口染毒可提供对 健康危害的信息。试验结果可作为化妆品原料毒性分级和标签标识以及确定亚慢性毒性试验 和其它毒理学试验剂量的依据。 4 定义

4.1 急性经口毒性（Acute oral toxicity ）：一次或在24h 内多次经口给予实验动物受试物后，动物在短期内出现的健康损害效应。

4.2 经口LD50 （半数致死量，Medium lethal dose ）：经口一次给予受试物后，引起实验动物 总体中半数死亡的毒物的统计学剂量。以单位体重接受受试物的重量（mg/kg 或g/kg ）来表示。

5 试验的基本原则

以管饲法经口给予各试验组动物不同剂量的受试物，每组用一个剂量，染毒剂量的选择可通过预试验确定。染毒后观察动物的毒性反应和死亡情况。试验期间死亡的动物要进行尸 检，试验结束时仍存活的动物要处死并进行尸检。本方法主要适用于啮齿类动物的研究，但 也可用于非啮齿类动物的研究。 6 试验方法 6.1 受试物

受试物应溶解或悬浮于适宜的介质中，建议首选水，其次是植物油(如玉米油) ，或考虑使用其它介质（如羧甲基纤维素、明胶、淀粉等）。对非水溶性介质，应了解其毒理特性， 否则应在试验前先确定其毒性。每次经口染毒液体的最大容量取决于实验动物的大小，对啮 齿类动物所给液体容量一般为1mL/100g，水溶液可至2mL/100g 。通过调整受试物溶液浓度 使各剂量组经口染毒的容量一致。 6.2 实验动物和饲养环境

首选健康成年大鼠和小鼠，也可选用其它敏感动物。使用雌性动物应是未孕和未曾产仔 的。实验动物体重之间相差不得超过平均体重的 20% 。试验前动物要在实验动物房环境中 至少适应3d～5d 时间。

实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用常规饲料，饮水不限制。 6.3 剂量水平

根据所选方法的要求，原则上应设4～6 个剂量组，每组动物一般为 10 只，雌雄各半。 各剂量组间距大小以兼顾产生毒性大小和死亡为宜，通常以较大组距和较少量动物进行预

试。如果受试物毒性很低，也可采用一次限量法，即用10 只动物（雌雄各半）口服5000mg/kg 体重剂量，当未引起动物死亡，可考虑不再进行多个剂量的急性经口毒性试验。 6.4 试验步骤

6.4.1 试验前，实验动物禁食过夜，不限制饮水。若采用代谢率高的其它动物，禁食时间可 以适当缩短。

6.4.2 正式试验时，称量动物体重，随机分组，然后对各组动物用管饲法一次进行染毒，若

估计受试物毒性很低，一次给予容量太大，也可在24h 内分2～3 次染毒，但合并作为一次剂量计算。染毒后继续禁食3h～4h 。若采用分批多次染毒，根据染毒间隔长短，必要时可给动物一定量的食物和水。

6.4.3 染毒后，对每只动物都应有单独全面的记录，染毒第 1d 要定时观察实验动物的中毒 表现和死亡情况，其后至少每天进行一次仔细的检查。详细记录被毛和皮肤、眼睛和粘膜， 呼吸、循环、自主神经和中枢神经系统、肢体活动和行为等改变。特别注意是否出现震颤、 抽搐、流涎、腹泻、嗜睡和昏迷等症状。应记录毒作用体征出现和消失的时间和死亡时间。 6.4.4 观察期限一般不超过14d，但观察时间并非一成不变，要视动物中毒反应的严重程度、 症状出现快慢和恢复期长短而定。若有死亡延迟迹象，可延长观察时间。

观察期内存活动物每周称重，观察期结束存活动物应称重，处死后进行尸检。

6.4.5 对实验动物进行大体解剖学检查，并记录全部大体病理改变。对死亡和存活 24h 和24h 以上动物并存在大体病理改变的器官应进行病理组织学检查。

6.4.6 可采用多种方法测定LD50，建议采用霍恩氏法、上-下法、概率单位-对数图解法和寇氏法等。

6.5 试验结果评价

评价试验结果时，应将LD50 与观察到的毒性效应和尸检所见相结合考虑，LD50 值是受试物毒性分级和标签标识以及判定受试物经消化道摄入后引起动物死亡可能性大小的依据。 引用LD50 值时一定要注明所用实验动物的种属、性别、染毒途径、观察期限等。评价应包 括动物接触受试物与动物异常表现（包括行为和临床改变、大体损伤、体重变化、致死效应 及其它毒性作用) 的发生率和严重程度之间的关系。 毒性分级见表1。 7 试验报告

试验报告应包括如下内容：

（1）受试物名称、理化性状、配制方法、所用浓度；

（2 ）实验动物的种属、品系和来源（注明合格证号和动物级别）；

（3 ）实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物房合格证号； （4 ）所用剂量和动物分组，每组所用动物性别、数量及体重范围；

（5 ）染毒后动物中毒表现和死亡情况及出现时间，大体解剖及病理所见； （6 ）计算LD50 的方法；

（7 ）列表报告结果和计算的LD50 及其95%可信区间（建议的表格形式见表2 ）； （8 ）结论。 8 试验结果的解释

急性经皮毒性试验研究和经皮LD50的确定提供了受试物经皮染毒的毒性。其结果外推 到人类的有效性很有限。急性经皮毒性试验的结果应与经其它途径染毒的急性毒性试验结果 相结合进行综合评价。

三、急性经皮毒性试验

Acute Dermal Toxicity Test

1 范围

本规范规定了动物急性皮肤毒性试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于化妆品原料安全性毒理学检测。 2 规范性引用文件

OECD Guidelines for Testing of Chemicals （No.402 ，Feb. 1987 ）

USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines （Series 870.1200，Aug. 1998 ） 3 试验目的

急性皮肤毒性试验可确定受试物能否经皮肤吸收和短期作用所产生的毒性反应，可为化 妆品原料毒性分级和标签标识以及确定亚慢性毒性试验和其它毒理学试验剂量提供依据。 4 定义

4.1 急性皮肤毒性（Acute dermal toxicity ）：经皮一次涂敷受试物后，动物在短期内出现的健康损害效应。

4.2 经皮LD50（半数致死量, Medium lethal dose ）：经皮一次涂敷受试物后，引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量。以单位体重涂敷受试物的重量（mg/kg 或g/kg ）来表示。

5 试验的基本原则

受试物以不同剂量经皮给予各组实验动物，每组用一个剂量。染毒后观察动物的毒性反 应和死亡情况。试验期间死亡的动物要进行尸检，试验结束时仍存活的动物要处死并进行尸 检。若已知受试物具有腐蚀性或强刺激性可不进行急性经皮毒性试验。 6 试验方法 6.1 受试物

液体受试物一般不需稀释。若受试物为固体，应研磨成细粉状，并用适量水或无毒、无 刺激性、不影响受试物穿透皮肤、不与受试物反应的介质混匀，以保证受试物与皮肤有良好 的接触。常用的介质有橄榄油、羊毛脂、凡士林等。 6.2 实验动物和饲养环境

可选用健康成年大鼠、家兔或豚鼠作为实验动物，也可使用其它种属动物进行试验。使 用雌性动物应是未孕和未曾产仔的。建议实验动物体重范围为：大鼠200g～300g ；家兔2kg～ 3kg ；豚鼠350g～450g 。实验动物皮肤应健康无破损。试验前动物要在实验动物房环境中至少适应3d～5d 时间。

实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用常规饲料，饮水不限制。 6.3 剂量水平

根据所选用的方法要求，原则上应设4～6 个剂量组，每组动物一般为10 只，雌雄各半。 各剂量组间距大小以兼顾产生毒性大小和死亡为宜，通常以较大组距和较少量动物进行预 试。如果受试物毒性很低，可采用一次限量法，即用10 只动物（雌雄各半）皮肤涂抹2000mg/kg 体重剂量，当未引起动物死亡，可考虑不再进行多个剂量的急性经皮毒性试验。 6.4 试验步骤

6.4.1 试验开始前24h ，剪去或剃除动物躯干背部拟染毒区域的被毛，去毛时应非常小心，不

要损伤皮肤以免影响皮肤的通透性。涂皮面积约占动物体表面积的10%，应根据动物体

22

重确定涂皮面积。体重为200g～300g 的大鼠约为30cm～40cm ，体重为2kg～3kg 的家兔约

2222

为160cm～210cm ，体重为350g～450g 的豚鼠约为46cm～54cm 。

6.4.2 将受试物均匀涂敷于动物背部皮肤染毒区，然后用一层薄胶片覆盖，无刺激胶布固定， 防止动物舔食。若受试物毒性较高，可减少涂敷面积，但涂敷仍需尽可能薄而均匀。一般封 闭接触24h 。

6.4.3 染毒结束后，应使用水或其它适宜的溶液清除残留受试物。

6.4.4 观察期限一般不超过14d，但要视动物中毒反应的严重程度、症状出现快慢和恢复期 长短而定。若有延迟死亡迹象，可考虑延长观察时间。

6.4.5 对每只动物都应有单独全面的记录，染毒第 1d 要定时观察实验动物的中毒表现和死 亡情况，其后至少每天进行一次仔细的检查。包括被毛和皮肤、眼睛和粘膜以及呼吸、循环、 自主神经和中枢神经系统、肢体运动和行为活动等的改变。特别注意观察动物是否出现震颤、 抽搐、流涎、腹泻、嗜睡、和昏迷等症状。死亡时间的记录应尽可能准确。

观察期内存活动物每周称重、观察期结束存活动物应称重，处死后进行尸检。

6.4.6 对实验动物进行大体解剖学检查，并记录全部大体病理改变。对死亡和存活 24h 和24h 以上动物并存在大体病理改变的器官应进行病理组织学检查。

6.4.7 可采用多种方法测定LD50，建议采用霍恩氏法、上-下法、概率单位-对数图解法和寇氏法等。

6.5 试验结果评价

评价试验结果时，应将经皮LD50 与观察到的毒性效应和尸检所见相结合考虑，LD50 值 是受试物毒性分级和标签标识以及判定受试物经皮肤吸收后引起动物死亡可能性大小的依 据。引用 LD50 值时一定要注明所用实验动物的种属、性别、染毒途径、观察期限等。评价 应包括动物接触受试物与动物异常表现（包括行为和临床改变、大体损伤、体重变化、致死 效应及其它毒性作用）的发生率和严重程度之间的关系。 毒性分级见表1。

7 试验报告

试验报告应包括如下内容：

（1）受试物名称、理化性状、配制方法、所用浓度；

（2 ）实验动物的种属、品系和来源（注明合格证号和动物级别）；

（3 ）实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物房合格证号； （4 ）所用剂量和动物分组，每组所用动物性别、数量及体重范围；

（5 ）染毒后动物中毒表现和死亡情况及出现时间，大体解剖及病理所见； （6 ）计算LD50 的方法；

（7 ）列表报告结果和计算LD50 及其95%可信区间（建议的表格形式见表2 ）； （8 ）结论。

8 试验结果的解释

急性经皮毒性试验研究和经皮LD50 的确定提供了受试物经皮染毒的毒性。其结果外推到人类的有效性很有限。急性经皮毒性试验的结果应与经其它途径染毒的急性毒性试验结果相结合进行综合评价。

四、皮肤刺激性/腐蚀性试验

Dermal Irritation/Corrosion Test 1 范围

本规范规定了动物皮肤刺激性或腐蚀性试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于化妆品原料及其产品安全性毒理学检测。 2 规范性引用文件

OECD Guidelines for Testing of Chemicals （No.404 ，April 2002 ）

USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines （Series 870. 2500，Aug. 1998 ） 3 试验目的

确定和评价化妆品原料及其产品对哺乳动物皮肤局部是否有刺激作用或腐蚀作用及其 程度。 4 定义

4.1 皮肤刺激性（Dermal irritation ）：皮肤涂敷受试物后局部产生的可逆性炎性变化。 4.2 皮肤腐蚀性（Dermal corrosion ）：皮肤涂敷受试物后局部引起的不可逆性组织损伤。 5 试验的基本原则

将受试物一次（或多次）涂敷于受试动物的皮肤上，在规定的时间间隔内，观察动物皮 肤局部刺激作用的程度并进行评分。采用自身对照，以评价受试物对皮肤的刺激作用。急性 皮肤刺激性试验观察期限应足以评价该作用的可逆性或不可逆性。

动物如果在试验的任何阶段出现严重抑郁、痛苦的表现，则应该给予人道地处死。依据 试验情况对受试物进行适当评价。 6 试验方法

6.1 受试物

液体受试物一般不需稀释，可直接使用原液。若受试物为固体，应将其研磨成细粉状， 并用水或其它无刺激性溶剂充分湿润，以保证受试物与皮肤有良好的接触。使用其它溶剂， 应考虑到该溶剂对受试物皮肤刺激性的影响。需稀释后使用的产品，先进行产品原型的皮肤 刺激性/腐蚀性试验，如果试验结果显示中度以上刺激性，可按使用浓度为受试物再进行皮 肤刺激性/腐蚀性试验。

受试物为强酸或强碱（pH 值≤2 或≥11.5），可以不再进行皮肤刺激试验。此外，若已 知受试物有很强的经皮吸收毒性，经皮LD50 小于200mg/kg 体重或在急性经皮毒性试验中受试物剂量为2000mg/kg 体重仍未出现皮肤刺激性作用，也无需进行急性皮肤刺激性试验。 6.2 实验动物和饲养环境

多种哺乳动物均可被选为实验动物，首选白色家兔。应使用成年、健康、皮肤无损伤的 动物，雌性和雄性均可，但雌性动物应是未孕和未曾产仔的。实验动物至少要用4 只，如要澄清某些可疑的反应则需增加实验动物数。实验动物应单笼饲养，试验前动物要在实验动物房环境中至少适应3d 时间。

实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用常规饲料，饮水不限制。 6.3 急性皮肤刺激性试验步骤

6.3.1 试验前约24h ，将实验动物背部脊柱两侧毛剪掉，不可损伤表皮，去毛范围左、右各约3cm×3cm 。

6.3.2 取受试物约0.5mL（g）直接涂在皮肤上，然后用二层纱布（2.5cm×2.5cm ）和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。另一侧皮肤作为对照。采用封闭试验，敷用时间为 4h 。对化妆品产品而言，可根据人的实际使用和产品类型，延长或缩短敷用时间。对用后冲洗的化妆品产品，仅采用2h 敷用试验。试验结束后用温水或无刺激性溶剂清除残留受试物。

如怀疑受试物可能引起严重刺激或腐蚀作用，可采取分段试验，将三个涂布受试物的纱 布块同时或先后敷贴在一只家兔背部脱毛区皮肤上，分别于涂敷后3min、60min 和4h 取下 一块纱布，皮肤涂敷部位在任一时间点出现腐蚀作用，即可停止试验。

6.3.3 于清除受试物后的1、24 、48 和72h 观察涂抹部位皮肤反应，按表1 进行皮肤反应评分，以受试动物积分的平均值进行综合评价，根据24 、48 和72 h 各观察时点最高积分均值， 按表2 判定皮肤刺激强度。

6.3.4 观察时间的确定应足以观察到可逆或不可逆刺激作用的全过程，一般不超过14d。 6.4 多次皮肤刺激性试验步骤

6.4.1 试验前将实验动物背部脊柱两侧被毛剪掉，去毛范围各为 3cm×3cm ，涂抹面积 2.5cm×2.5cm 。

6.4.2 取受试物约 0.5mL（g ）涂抹在一侧皮肤上，当受试物使用无刺激性溶剂配制时，另一侧涂溶剂作为对照，每天涂抹1 次，连续涂抹14d。从第二天开始，每次涂抹前应剪毛，用水或无刺激性溶剂清除残留受试物。一小时后观察结果，按表1 评分，对照区和试验区同样处理。 6.4.3 结果评价：按下列公式计算每天每只动物平均积分，以表2 判定皮肤刺激强度。

7 试验报告

试验报告应以表格形式总结，包括如下内容：

（1）受试物名称、理化性状、配制方法和用量。必要时说明受试物的pH 值； （2 ）实验动物的种属、品系、性别、体重和来源（注明合格证号和动物级别）； （3 ）实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物房合格证号； （4 ）每个动物在每一观察时点的皮肤刺激反应积分； （5 ）具体描述除刺激性以外的其它毒性作用； （6 ）结论。 8 试验结果的解释

急性皮肤刺激试验结果从动物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多数情况下对有 刺激性或腐蚀性的物质较人类敏感。若用其它品系动物进行试验时也得到类似结果，则会增 加从动物外推到人的可靠性。试验中使用封闭式接触是一种超常的实验室条件下的试验，在 人类实际使用化妆品过程中很少存在这种接触方式。

五、急性眼刺激性/腐蚀性试验

Acute Eye Irritation/Corrosion Test 1 范围

本规范规定了动物急性眼刺激性或腐蚀性试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于化妆品原料及其产品安全性毒理学检测。 2 规范性引用文件

OECD Guidelines for Testing of Chemicals （No 405 ，April 2002 ） USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines （Series 870.2400，Aug.1998 ） 3 试验目的

确定和评价化妆品原料及其产品对哺乳动物的眼睛是否有刺激作用或腐蚀作用及其程 度。 4 定义

4.1 眼睛刺激性（Eye irritation ）：眼球表面接触受试物后所产生的可逆性炎性变化。 4.2 眼睛腐蚀性（Eye corrosion ）：眼球表面接触受试物后引起的不可逆性组织损伤。 5 试验的基本原则

受试物以一次剂量滴入每只实验动物的一侧眼睛结膜囊内，以未作处理的另一侧眼睛作 为自身对照。在规定的时间间隔内，观察对动物眼睛的刺激和腐蚀作用程度并评分，以此评 价受试物对眼睛的刺激作用。观察期限应能足以评价刺激效应的可逆性或不可逆性。

动物如果在试验的任何阶段出现严重抑郁、痛苦的表现，则应该给予人道地处死，依据 试验情况对受试物进行适当评价。动物如出现角膜穿孔、角膜溃疡、角膜4 分超过48h 、缺乏光反射超过72h、结膜溃疡、坏疽、腐烂等情况，通常为不可逆损伤的症状，也应该给予人道地处死。 6 试验方法 6.1 受试物

液体受试物一般不需稀释，可直接使用原液，染毒量为0.1mL 。若受试物为固体或颗粒状，应将其研磨成细粉状，染毒量应为体积 0.1mL 或重量不大于 100mg （染毒量应进行记录）。 受试物为强酸或强碱（pH 值≤2 或≥11.5），或已证实对皮肤有腐蚀性或强刺激性时， 可以不再进行眼刺激性试验。

气溶胶产品需喷至容器中，收集其液体再使用。 6.2 实验动物和饲养环境

首选健康成年白色家兔。至少使用3 只家兔。试验前动物要在实验动物房环境中至少适 应3d 时间。在试验开始前的24h 内要对试验动物的两只眼睛进行检查（包括使用荧光素钠检查）。有眼睛刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤的动物不能用于试验。

实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用常规饲料，饮水不限制。 6.3 试验步骤

6.3.1 轻轻拉开家兔一侧眼睛的下眼睑，将受试物0.1mL（100mg）滴入（或涂入）结膜囊中，使上、下眼睑被动闭合 1s，以防止受试物丢失。另一侧眼睛不处理作自身对照。滴入受试物后24h 内不冲洗眼睛。若认为必要，在24h 时可进行冲洗。

6.3.2 若上述试验结果显示受试物有刺激性，需另选用3 只家兔进行冲洗效果试验，即给家兔眼滴入受试物后30s，用足量、流速较快但又不会引起动物眼损伤的水流冲洗至少30s 。 6.3.3 临床检查和评分：在滴入受试物后1、24 、48 、72h 以及第4d 和第7d 对动物眼睛进行检查。如果72h 未出现刺激反应，即可终止试验。如果发现累及角膜或有其它眼刺激作用，7d 内不恢复者，为确定该损害的可逆性或不可逆性需延长观察时间，一般不超过21d ，并提供第7d、14d、21d 的观察报告。除了对角膜、虹膜、结膜进行观察外，其它损害效应均应当

记录并报告。在每次检查中均应按表1 眼损害的评分标准记录眼刺激反应的积分。

可使用放大镜、手持裂隙灯、生物显微镜或其它适用的仪器设备进行眼刺激反应检查。 在24h 观察和记录结束之后，对所有动物的眼睛应用荧光素钠作进一步检查。

6.3.4 对用后冲洗的产品（如洗面奶、发用品、育发冲洗类等）只做30s 冲洗试验，即 滴入受试物后，眼闭合 1s，至第 30s 时用足量、流速较快但又不会引起动物眼损伤的 水流冲洗30s ，然后按6.3.3 进行检查和评分。

6.3.5 对染发剂类产品，只做4s 冲洗试验，即滴入受试物后，眼闭合 1s，至第4s 时用 足量、流速较快但又不会引起动物眼损伤的水流冲洗30s ，然后按6.3.3 进行检查和评分。

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结果评价

化妆品原料——以给受试物后动物角膜、虹膜或结膜各自在24 、48 和72h 观察时点的刺激反应积分的均值和恢复时间评价，按表2 眼刺激反应分级判定受试物对眼的刺激强度。

化妆品产品——以给受试物后动物角膜、虹膜或结膜各自在24 、48 或72h 观察时点的刺激反应的最高积分和恢复时间评价，按表3 眼刺激反应分级判定受试物对眼的刺激强度。

8 试验报告

试验报告应包括如下内容：

（1）受试物名称、理化性状、配制方法和用量，必要时说明受试物的pH 值； （2 ）实验动物的种属、品系和来源（注明合格证号和动物级别）；

（3 ）实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物房合格证号； （4 ）列表显示每只动物在每一观察时点（如染毒1，24 ，48 和 72h ）的刺激反 应（建议的表格形式见表4 ），将实验条件不冲洗和30 秒冲洗或4 秒冲洗的结果分别列表； （5 ）具体描述除眼部以外的其它作用；

（6 ）描述在各观察时点积分时的检查方法（如手持裂隙灯、用荧光素钠）； （7 ）结论。 9 试验结果的解释

急性眼刺激性试验结果从动物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多数情况下对有 刺激性或腐蚀性的物质较人类敏感。若用其它品系动物进行试验时也得到类似结果，则会增 加从动物外推到人的可靠性。

六、皮肤变态反应试验

Skin Sensitisation Test 1 范围

本规范规定了动物皮肤变态反应试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于化妆品原料及其产品安全性毒理学检测。 2 规范性引用文件

OECD Guidelines for Testing of Chemicals （No 406 ，July 1992 ）

USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines （Series 870.2600，Aug.1998 ） 3 试验目的

确定重复接触化妆品及其原料对哺乳动物是否可引起变态反应及其程度。 4 定义

4.1 皮肤变态反应（过敏性接触性皮炎）（Skin sensitization，allergic contact dermatitis ） 是皮肤对一种物质产生的免疫源性皮肤反应。在人类这种反应可能以瘙痒、红斑、丘疹、 水疱、融合水疱为特征。动物的反应不同，可能只见到皮肤红斑和水肿。 4.2 诱导接触（Induction exposure ）

指机体通过接触受试物而诱导出过敏状态的试验性暴露。 4.3 诱导阶段（Induction period ）

指机体通过接触受试物而诱导出过敏状态所需的时间，一般至少一周。 4.4 激发接触（Challenge exposure ）

机体接受诱导暴露后，再次接触受试物的试验性暴露，以确定皮肤是否会出现过敏反应。 5 试验的基本原则

实验动物通过多次皮肤涂抹（诱导接触）或皮内注射受试物10d～14d（诱导阶段）后， 给予激发剂量的受试物，观察实验动物并与对照动物比较对激发接触受试物的皮肤反应强 度。

5.1 实验动物和饲养环境

一般选用健康、成年雄性或雌性豚鼠，雌性动物应选用未孕或未曾产仔的。

实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用常规饲料，饮水不限制，需注意补充 适量Vc 。

5.2 动物试验前准备

试验前动物要在实验动物房环境中至少适应3d～5d 时间。将动物随机分为受试物组和对照组，按所选用的试验方法，选择适当部位给动物备皮（去毛），避免损伤皮肤。试验开始和结束时应记录动物体重。

5.3 无论在诱导阶段或激发阶段均应对动物进行全面观察包括全身反应和局部反应，并作 完整记录。

5.4 试验方法可靠性的检查

使用已知的能引起轻度/ 中度致敏的阳性物每隔半年检查一次。局部封闭涂皮法至少有30%动物出现皮肤过敏反应；皮内注射法至少有60%动物出现皮肤过敏反应。阳性物一般采用2,4-二硝基氯代苯，肉桂醛，2-巯基苯并噻唑或对氨基苯酸乙酯。 6 试验方法

6.1 局部封闭涂皮试验（Buehler Test ，BT ） 6.1.1 动物数

试验组至少20 只，对照组至少10 只。 6.1.2 剂量水平

诱导接触受试物浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度，激发接触受试物浓度为不 能引起皮肤刺激反应的最高浓度。试验浓度水平可以通过少量动物（2～3 只）的预试验获得。 水溶性受试物可用水或用无刺激性表面活性剂作为赋形剂，其它受试物可用80%乙醇 （诱导接触）或丙酮（激发接触）作赋形剂。 6.1.3 试验步骤

6.1.3.1 试验前约24h ，将豚鼠背部左侧去毛，去毛范围为4cm ～6cm 。

6.1.3.2 诱导接触：将受试物约 0.2mL（g ）涂在实验动物去毛区皮肤上，以二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布封闭固定6h 。第7d 和第14d 以同样方法重复一次。

6.1.3.3 激发接触：末次诱导后14d～28d，将约0.2mL 的受试物涂于豚鼠背部右侧2cm ×2cm 去毛区（接触前24h 脱毛），然后用二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布固定6h 。 6.1.3.4 激发接触后24h 和48h 观察皮肤反应，按表1 评分。

6.1.3.5 试验中需设阴性对照组，使用 6.1.3.2 和6.1.3.3 的方法，在诱导接触时仅涂以溶剂作为对照，在激发接触时涂以受试物。对照组动物必须和受试物组动物为同一批。在实验室开展变态反应试验初期，或使用新的动物种属或品系时，需同时设阳性对照组。

6.1.4 结果评价

6.1.4.1 当受试物组动物出现皮肤反应积分≥2 时，判为该动物出现皮肤变态反应阳性，按表3 判定受试物的致敏强度。

6.1.4.2 如激发接触所得结果仍不能确定，应于第一次激发后一周，给予第二次激发，对照 组作同步处理或按6.2的方法进行评价。

6.2 豚鼠最大值试验（Guinea Pig Maximinatim Test，GPMT ）

采用完全福氏佐剂（Freund Complete Adjvant，FCA）皮内注射方法检测致敏的可能性。 6.2.1 动物数

试验组至少用10只，对照组至少5只。如果试验结果难以确定受试物的致敏性，应增加动物数，试验组20只，对照组10只。 6.2.2 剂量水平

诱导接触受试物浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度，激发接触受试物浓度为不 能引起皮肤刺激反应的最高浓度。试验浓度水平可以通过少量动物（2～3 只）的预试验获得。 6.2.3 试验步骤

6.2.3.1 诱导接触（第0d ）

受试物组：将颈背部去毛区（2cm ×4cm ）中线两侧划定三个对称点，每点皮内注射0.1mL下述溶液。

第1点 1 ：1 （v/v ）FCA/水或生理盐水的混合物。 第2点 耐受浓度的受试物。

第3点 用1：1 （v/v ）FCA/水或生理盐水配制的受试物，浓度与第2点相同。 对照组：注射部位同受试物组。

第1点 1 ：1 （v/v ）FCA/水或生理盐水的混合物。 第2点 未稀释的溶剂。

第3点 用1：1 （v/v ）FCA/水或生理盐水配制的浓度为 50% （w/v ）的溶剂。 6.2.3.2 诱导接触（第7d ）：

将涂有0.5g （mL ）受试物的2cm ×4cm滤纸敷贴在上述再次去毛的注射部位，然后用两层纱布，一层玻璃纸覆盖，无刺激胶布封闭固定48h 。对无皮肤刺激作用的受试物，可加强致敏，于第二次诱导接触前24h在注射部位涂抹10%十二烷基硫酸钠（SLS ）0.5mL 。对照组

仅用溶剂作诱导处理。

6.2.3.3 激发接触（第21d ）

将豚鼠躯干部去毛，用涂有0.5g（mL ）受试物的2cm ×2cm滤纸片敷贴在去毛区，然后再用两层纱布，一层玻璃纸覆盖，无刺激胶布封闭固定24h 。对照组动物作同样处理。如激发接触所得结果不能确定，可在第一次激发接触一周后进行第二次激发接触。对照组作同步处理。 6.2.4 观察及结果评价

激发接触结束，除去涂有受试物的滤纸后24 、48和72h，观察皮肤反应（如需要清除受试残留物可用水或选用不改变皮肤已有反应和不损伤皮肤的溶剂），按表2评分。当受试物组动物皮肤反应积分≥1时，应判为变态反应阳性，按表3对受试物进行致敏强度分级。

7

试验报告

报告应包括如下内容：

（1）受试物名称、理化性状、配制方法、所用浓度；

（2 ）实验动物的种属、品系、来源（注明合格证号和动物级别）、性别、数量； （3 ）实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物房合格证号； （4 ）试验方法；

（5 ）试验开始和结束时动物体重；

（6 ）结果：以表格形式报告各组动物皮肤反应情况和致敏率等（建议的表格形式见表4和表5 ）；

（7 ）结论。

8 试验结果的解释

试验结果应能得出受试物的致敏能力和强度。这些结果只能在很有限的范围内外推到人 类。引起豚鼠强烈反应的物质在人群中也可能引起一定程度的变态反应，而引起豚鼠较弱反 应的物质在人群中也许不能引起变态反应。

七、皮肤光毒性试验

Skin Phototoxicity Test 1 范围

本规范规定了皮肤光毒性试验的基本原则，要求和方法。 本规范适用于化妆品原料及其产品安全性毒理学检测。 2 试验目的

评价化妆品原料及其产品引起皮肤光毒性的可能性。

3 定义

光毒性（Phototoxicity ）：皮肤一次接触化学物质后，继而暴露于紫外线照射下所引发的一种皮肤毒性反应，或者全身应用化学物质后，暴露于紫外线照射下发生的类似反应。 4 试验的基本原则

将一定量受试物涂抹在动物背部去毛的皮肤上，经一定时间间隔后暴露于UVA 光线下， 观察受试动物皮肤反应并确定该受试物有否光毒性。 5 试验方法 5.1 受试物

液体受试物一般不用稀释，可直接使用原液。若受试物为固体，应将其研磨成细粉状并 用水或其它溶剂充分湿润，在使用溶剂时，应考虑到溶剂对受试动物皮肤刺激性的影响。对 于化妆品产品而言，一般使用原霜或原液。阳性对照物选用 8- 甲氧基补骨脂 （8-methoxypsoralen，8-Mop）。 5.2 实验动物和饲养条件

使用成年白色家兔或白化豚鼠，尽可能雌雄各半。选用6 只动物进行正式试验。试验前动物要在实验动物房环境中至少适应3d～5d 时间。

实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用常规饲料，饮水不限制，需注意补充 适量Vc 。 5.3 UV 光源

5.3.1 UV 光源：波长为320nm～400nm 的UVA ，如含有UVB ，其剂量不得超过0.1J/cm 。

5.3.2 强度的测定：用前需用辐射计量仪在实验动物背部照射区设 6 个点测定光强度 （mW/cm2 ），以平均值计。

2 ，按下式计算照射时间。 5.3.3 照射时间的计算：照射剂量为10J/cm

5.4 试验步骤

5.4.1 进行正式光毒试验前 18h～24h，将动物脊柱两侧皮肤去毛，试验部位皮肤需完好，无损伤及异常。备4 块去毛区（见图1），每块去毛面积约为2cm ×2cm 。

5.4.2 将动物固定，按表 1 所示，在动物去毛区 1 和2 涂敷0.2mL（g ）受试物。所用受试物浓度不能引起皮肤刺激反应（可通过预试验确定），30min 后，左侧（去毛区1 和3 ）用铝箔复盖，胶带固定，右侧用UVA 进行照射。 5.4.3 结束后分别于1、24 、48 和72h 观察皮肤反应，根据表2 判定每只动物皮肤反应评分。 5.4.4 为保证试验方法的可靠性，至少每半年用阳性对照物检查一次。即在去毛区 1 和 2

涂阳性对照物，方法同5.4.2 。

6 结果评价

单纯涂受试物而未经照射区域未出现皮肤反应，而涂受试物后经照射的区域出现皮肤反 应分值之和为2 或2 以上的动物数为1 只或1 只以上时，判为受试物具有光毒性。 7 试验报告

报告应包括下列内容：

（1）受试物名称、理化性状、配制方法、所用浓度；

（2 ）动物种属、品系、性别、体重、来源（注明合格证号和动物级别）；

（3 ）实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物房合格证号； （4 ）光源的生产厂、规格；

（5 ）光强度和照射时间以及试验方法；

（6 ）结果：以列表方式报告动物出现皮肤反应的积分（见表3 和表4 ）； （7 ）结论。

八、鼠伤寒沙门氏菌／回复突变试验

Salmonella Typhimurium/Reverse Mutation Assay 1 范围

本规范确定了鼠伤寒沙门氏菌／回复突变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于化妆品原料及其产品的基因突变检测。 2 规范性引用文件

OECD Guidelines for Testing of Chemicals （No.471 ，Adopted ：21 ，July 1997 ） 3 定义

3.1 回复突变（Reverse mutation ）

细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph) 。 3.2 基因突变（Gene mutation ）

在化学致突变物作用下细胞DNA 中碱基对的排列顺序发生变化。 3.3 碱基置换突变（Base substitution mutation ） 引起DNA 链上一个或几个碱基对的置换。

碱基置换有转换（transition ）和颠换（transversion ）两种形式。

转换是DNA 链上的一个嘧啶被另一嘧啶所替代，或一个嘌呤被另一嘌呤所代替。 颠换是DNA 链上的一个嘧啶被另一嘌呤所替代，或一个嘌呤被另一嘧啶所代替。 3.4 移码突变（Frameshift mutation ）

引起DNA 链上增加或缺失一个或多个碱基对。

3.5 鼠伤寒沙门氏菌/ 回复突变试验（Salmonella typhimurium/reverse mutation assay） 利用一组鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型试验菌株测定引起沙门氏菌碱基置换或移码突变 的化学物质所诱发的组氨酸缺陷型（his- ）→原养型（his+ ）回复突变的试验方法。

3.6 S9

经多氯联苯（PCB 混合物）或苯巴比妥钠和β-萘黄酮结合诱导的大鼠制备肝匀浆，在9000g 下离心10min 后的肝匀浆上清液。 4 原理

鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅 少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养 型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。

某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备 的S9 混合液。 5 仪器和设备

培养箱、恒温水浴、振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热烤箱、低温冰箱(-80℃)或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g 和0.0001g)、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机，玻璃器皿等。

6 培养基和试剂

6.1 0.5mmol/L 组氨酸-0.5mmol/L 生物素溶液

成分：L-组氨酸（MW 155 ） 78mg D-生物素(MW 244) 122mg 加蒸馏水至 1000mL

配制：将上述成分加热，以溶解生物素，然后在0.068MPa 下高压灭菌20min，储于4℃冰箱。

6.2 顶层琼脂培养基

成分：琼脂粉 1.2g 氯化钠 1.0g 加蒸馏水至 200mL

配制：上述成分混合后，于0.103MPa 下高压灭菌30min 。实验时，加入0.5mmol/L 组 氨酸-0.5mmol/L 生物素溶液20mL 。 6.3 Vogel-Bonner （V-B ）培养基E

成分：枸椽酸 100g 磷酸氢二钾 500g 磷酸氢铵钠 175g 硫酸镁 10g 加蒸馏水至 1000mL

配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸馏水至 1000mL。于0.103MPa 下高压灭菌30min，储于4 ℃冰箱。 6.4 20%葡萄糖溶液

成分：葡萄糖 200g 加蒸馏水至 1000mL 配制：加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水至1000mL。于0.068MPa 下高压灭菌20min，储于4℃冰箱。 6.5 底层琼脂培养基

成分：琼脂粉 7.5g 蒸馏水 480mL V-B 培养基E 10mL 20%葡萄糖溶液 10mL

配制：首先将前两种成分于0.103MPa 下高压灭菌30min 后，再加入后两种成分，充分 混匀倒底层平板。按每皿25mL 制备平板，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中24h ，备用。 6.6 营养肉汤培养基

成分：牛肉膏 2.5g 胰胨 5.0g 磷酸氢二钾（K HPO ） 1.0g 加蒸馏水至 500mL 配制：将上述成分混合后，于0.103MPa 下高压灭菌30min，储于4 ℃冰箱。 6.7 盐溶液（1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2 ）

成分：氯化钾（KCl ） 61.5g 氯化镁 40.7g 加蒸馏水至 500mL

配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa 下高压灭菌30min，储于4 ℃冰箱。

6.8 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4 ）

成分：磷酸二氢钠 2.965g 磷酸氢二钠 29.015g

加蒸馏水至 500mL 配制：溶解上述成分后，于0.103MPa 下高压灭菌30min，储于4 ℃冰箱。 6.9 S9 混合液

成分： 每毫升S9 混合液 肝S9 100μL 盐溶液 20μL 灭菌蒸馏水 380μL 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液 500μL 辅酶II （NADP ） 4μmol 6-磷酸葡萄糖（G-6-P ） 5μmol 配制：将辅酶 II 和 6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重，然后按上述相反的次序加入各种成分，使肝S9 加到已有缓冲液的溶液中。该混合液必须临用现配，并保存于冰水浴中。 实验结束，剩余S9 混合液应该丢弃。 6.10 菌株鉴定用和特殊用途试剂 6.10.1 组氨酸—生物素平板

成分：琼脂粉 15g 蒸馏水 944mL V-B 培养基E 20mL

20%葡萄糖 20mL

灭菌盐酸组氨酸水溶液（0.5g/100mL ） 10mL 灭菌0.5mmol/L 生物素溶液 6mL

配制：高压灭菌琼脂和水后，将灭菌20%葡萄糖，V-B 培养基和组氨酸溶液加进热的琼 脂溶液中。待溶液稍为冷却后，加入灭菌生物素，混匀，浇制平板。 6.10.2 氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/ 四环素平板

成分：琼脂粉 15g 蒸馏水 940mL V-B 盐溶液 20mL 20%葡萄糖 20mL

灭菌盐酸组氨酸溶液（0.5g/100mL ） 10mL 灭菌0.5mmol/L 生物素溶液 6mL

氨苄青霉素溶液（8mg/mL 于0.02mol/LNaOH 中） 3.15mL 四环素溶液（8mg/mL 于0.02mol/L HCl 中） 0.25mL 配制：琼脂和水高压灭菌 20min，将无菌的葡萄糖、VB 盐溶液和组氨酸-生物素溶液加进热的溶液中去，混匀。冷却至大约50℃，无菌条件下加入四环素溶液和/或氨苄青霉素溶液。应该在倾注琼脂平板后几天内，制备主平板。 6.10.3 营养琼脂平板

成份：琼脂粉 7.5g 营养肉汤培养基 500mL 配制：于0.103MPa 下高压灭菌30min 后倾注平板。

7 试验菌株及其生物学特性鉴定 7.1 试验菌株

采用TA97、TA98、TA100 和TA102 一组标准测试菌株。 7.2 生物学特性鉴定

新获得的或长期保存的菌种，在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定。菌株鉴定的判断 标准，如表1 所示。

7.2.1 组氨酸缺陷

原理：组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基上生长， 而在缺乏组氨酸的培养基上，则不能生长。

鉴定方法：将测试菌株增菌液分别于含组氨酸培养基平板和无组氨酸平板上划线，于

37℃下培养24h 后观察结果。

结果判断：组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长，而在无组氨酸平板上则不能生长。 7.2.2 脂多糖屏障缺损

原理：具有深粗糙（rfa ）的菌株，其表面一层脂多糖屏障缺损，因此一些大分子物质如结晶紫能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受其影响。

鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL 于营养琼脂平板上划线，然后将浸湿的0.1%结 晶紫溶液滤纸条与划线处交叉放置。37℃下培养24h 后观察结果。 结果判断：假若待测菌在滤纸条与划线交叉处出现一透明菌带，说明该待测菌株具有rfa 突变。

7.2.3 氨苄青霉素抗性

原理：含R 因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性。因为R 因子不太稳定，容易丢失， 故用氨苄青霉素确定该质粒存在与否。

鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL，在氨苄青霉素平板上划线，37℃下培养24h 后 观察结果。

结果判断：假若测试菌在氨苄青霉素平板上生长，说明该测试菌具有抗氨苄青霉素作用， 表示含R 因子，否则，表示测试菌不含R 因子或R 因子丢失。 7.2.4 紫外线敏感性

原理：具有△uvrB 突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能生长，而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。

鉴定方法：吸取待测菌株增菌液 0.1mL 于营养琼脂平板上划线，用黑纸盖住平板的一 半，置紫外灯下照射（15W，距离33cm ）8 秒钟。置37℃下孵育24h 后观察结果。

结果判断：具有△uvrB 突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具有完整的切除修复系统的菌株，则照常生长。 7.2.5 四环素抗性

原理：具有pAQI 的菌株对四环素有抗性。

鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL 于氨苄青霉素/ 四环素平板上划线，置37℃下孵育24h 后观察结果。

结果判断：假若测试菌照常在氨苄青霉素/ 四环素平板上生长，表明该测试菌株对氨苄 青霉素和四环素两者有抗性，具有pAQI 质粒，否则，说明测试菌株不含pAQI 质粒。 7.2.6 自发回变

原理：每种试验菌株都以一定的频率自发地产生回变，称为自发回变。这种自发回变是 每种试验菌株的一项特性。

鉴定方法：将待测菌株增菌液0.1mL 加到2mL 含组氨酸—生物素的顶层琼脂培养基的 试管内，混匀后铺到于底层琼脂平板上，待琼脂固化后，置 37℃培养箱中孵育48h 后记数每皿回变菌落数。

结果判断：每种标准测试菌株的自发回变菌落数应符合表1 要求。经体外代谢活化后的自发回变菌落数，要比直接作用下的略高。 7.2.7 回变特性-诊断性试验

原理：每种试验菌株对诊断性诱变剂回变作用的性质以及S9 混合液的效应不一。 鉴定方法：按照平板掺入试验的操作步骤进行。将受试物换成诊断性诱变剂。 结果判断：标准菌株对某些诊断性诱变剂特有的回变结果参见表2 。

8 大鼠肝微粒体酶的诱导和S9 的制备 8.1 诱导

最广泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯联苯（PCB 混合物），选择健康雄性大鼠 体重200g 左右，一次腹腔注射诱导剂，剂量为500mg/kg 体重。诱导剂溶于玉米油中，浓度为200mg/mL 。动物经多氯联苯诱导后第五日断头处死，处死前12h 停止饮食，但可自由饮水。 苯巴比妥钠和β-萘黄酮结合也可做为诱导剂，健康雄性大鼠体重200g 左右，经口或腹腔注射80mg/kg 苯巴比妥钠和80mg/kg β-萘黄酮，连续3 天。处死前 16h 停止饮食，但可自由饮水。由于化学物质经腹腔注射，容易引起肝脏形成外皮，不易剥离，推荐使用经口灌胃的方式。

8.2 S9 制备

首先，用 75%酒精消毒动物皮毛，剖开腹部。在无菌条件下，取出肝脏，去除肝脏的 结缔组织，用冰浴的0.15mol/L 氯化钾溶液淋洗肝脏，放入盛有0.15mol/L 氯化钾溶液的烧杯里。按每克肝脏加入0.15mol/L 氯化钾溶液3mL 。用电动匀浆器制成肝匀浆，再在低温高速离心机上，在4 ℃条件下，以9000g 离心 10min，取其上清液（S9 ）分装于塑料管中。每管装2 mL ～3 mL 。储存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中备用。

上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行。制备肝S9 所用一切手术器械、器皿等， 均经灭菌消毒。S9 制备后，其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定。 9 溶剂的选择

如果受试物为水溶性，可用灭菌蒸馏水作为溶剂；如为脂溶性，应选择对试验菌株毒 性低且无致突变性的有机溶剂，常用的有二甲基亚砜（DMSO ）、丙酮、95%乙醇。一般操 作中，为了减少误差和溶剂的影响，常按每皿使用剂量用同一溶剂配成不同的浓度，固定 加入量为100μL 。 10 剂量的设计

决定受试物最高剂量的标准是对细菌的毒性及其溶解度。自发回变数的减少，背景菌变 得清晰或被处理的培养物细菌存活数减少，都是毒性的标志。

对原料而言，一般最高剂量组可为 5mg/皿。对产品而言，有杀菌作用的受试物，最高 剂量可为最低抑菌浓度，无杀菌作用的受试物，最高剂量可为原液。受试物至少应设四个剂 量组。每个剂量均做三个平行平板。 11 试验操作步骤 11.1 增菌培养

取营养肉汤培养基 5mL，加入无菌试管中，将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于 营养肉汤培养基内，37℃振荡（100 次/min ）培养10h。该菌株培养物应每毫升不少于1～2 活菌数。

11.2 平板掺入法

实验时，将含0.5mmol/L 组氨酸-0.5mmol/L 生物素溶液的顶层琼脂培养基2.0mL 分装 于试管中，45 ℃水浴中保温，然后每管依次加入试验菌株增菌液0.1mL，受试物溶液0.1mL 和S9 混合液0.5mL （需代谢活化时），充分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上，转动平板，使之分布均匀。水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培养箱里孵育48h 。记数每皿回变菌落数。 实验中，除设受试物各剂量组外，还应同时设空白对照、溶剂对照、阳性诱变剂对照和 无菌对照。

12 数据处理和结果判断

记录受试物各剂量组、空白对照（自发回变）、溶剂对照以及阳性诱变剂对照的每皿回 变菌落数，并求平均值和标准差。

如果受试物的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的两倍或两倍以上，并呈剂量-反应关 系者，则该受试物判定为致突变阳性。

受试物经上述四个试验菌株测定后，只要有一个试验菌株，无论在加S9 或未加S9 条件下为阳性，均可报告该受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性。如果受试物经四个试验菌株检测后，无论加S9 和未加S9 均为阴性，则可报告该受试物为致突变阴性。 13 试验报告

试验报告应包括以下内容：

（1）受试物名称、理化性状、配制方法、使用溶剂； （2 ）试验菌株：所用试验菌株； （3 ）代谢活化系统：所用诱导剂；

（4 ）试验方法：简述操作步骤，除受试物剂量分组外，还应说明空白对照、溶剂对照和阳性对照，阳性结果判定标准；

（5 ）结果：以列表方式报告受试物的Ames 实验结果（参见表1）； （6 ）结论。

九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test

1 范围

本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。 2 规范性引用文件

OECD Guidelines for Testing of Chemicals （No.473 ，July 1997 ） 3 试验目的

本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。 4 定义

4.1 结构畸变（Structural aberration ）：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。结构畸变可分为以下两类。 4.1.1 染色体型畸变（Chromosome-type aberration ）：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。

4.1.2 染色单体型畸变（Chromatid-type aberration ）：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。 4.2 有丝分裂指数（Mitotic index ）：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。 5 试验基本原则

在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中 期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞， 制片，染色，分析染色体畸变。

大部分的致突变剂导致染色单体型畸变，偶有染色体型畸变发生。虽然多倍体的增加可 能预示着有染色体数目畸变的可能，但本方法并不适合用于测定染色体的数目畸变。 6 试验方法

6.1 试剂和受试物制备

6.1.2 阴性对照物：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其它处理 和受试物组完全相同。此外，如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空 白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。 6.1.3 受试物

6.1.3.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受 试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则 就必须证实贮存不影响其稳定性。

6.1.3.2 溶剂的选择：溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活 和 S9 活性。首选溶剂是培养液（不含血清）或水。二甲基亚砜（DMSO ）也是常用溶剂， 使用时浓度不应大于0.5% 。 6.1.3.3 受试物浓度设置

（1）最高浓度的选择：

决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH 或渗克分子浓 度（osmolality ）的改变。

（2 ）细胞毒性的确定：

应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在的两种条件下确定 细胞毒性，例如细胞覆盖程度（degree of confluency ）、存活细胞计数（viable cell counts）或 有丝分裂指数（mitotic index ）。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。 （3 ）剂量设置：

①至少应设置3 个可供分析的浓度。当有细胞毒性时，其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性；通常浓度间隔系数不大于2～ 10 。

②在收获细胞时，最高浓度应能明显降低细胞覆盖程度、细胞计数或有丝分裂指数（均 应大于50% ）。

③对于那些相对无细胞毒性的化合物，最高浓度应是5μL/mL ，5mg/mL 或0.01mol/L 。 ④对于相对不溶解的物质，当浓度低于不溶解浓度时仍无毒性，则最高剂量应是，当处 理期结束时，在最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度。在某些情况下（即仅当高于最低 不溶解浓度时才发生细胞毒性），应使用一个以上可看见沉淀的浓度。最好在试验处理开始 和结束时均评价溶解度，因为由于细胞、S9 等的存在，在试验系统内在暴露过程中溶解度可能变化。不溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不能影响观察。

6.2 试验步骤

6.2.1 细胞：可使用已建立的细胞株或细胞系，也可使用原代培养细胞。所使用的细胞应该 在生长性能、染色体数目和核型、自发的染色体畸变率等方面有一定的稳定性。推荐使用中 国地鼠卵巢（CHO ）细胞株或中国地鼠肺（CHL ）细胞株。

6.2.2 试验时，应同时设阳性对照物，阴性对照物和至少3 个可供分析的受试物浓度组。 6.2.3 试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿（瓶）中，放CO2 培养箱内培养。 6.2.4 试验需在加入和不加入 S9 mix 的条件下进行。试验时，吸去培养皿（瓶）中的培养液，加入一定浓度的受试物、S9 mix（不加S9 mix 时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中处理3h～6h 。结束后，吸去含受试物的培养液，用Hanks 液洗细胞3 次，加入含10%胎牛血清的培养液，放回培养箱，于24h 内收获细胞。于收获前2h～4h ，加入细胞分裂中期阻断剂（如用秋水仙素，作用时间为4h ，终浓度为1μg/mL ）。 当受试物为原料时, 如果在上述加入和不加入S9 mix 的条件下均获得阴性结果，则尚需补加另外的试验，即在不加S9 mix 的条件下，使受试物与试验系统的接触时间延长至24h 。 当难以得出明确结论时，应更换试验条件，如改变代谢活化条件、受试物与试验系统接 触时间等重复试验。

6.2.5 收获细胞时，用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞脱落后，加入含 10%胎牛或小

牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以 1000rpm～1200rpm 的速度离心5min～7min，弃去上清液，加入0.075mol/L KC1 溶液低渗处理，继而以新配制的甲醇和冰醋酸液（容积比为3:1 ）进行固定。空气干燥或火焰干燥法常规制片，用姬姆萨染液染色。 6.2.6 作染色体分析时，对化妆品终产品，每一处理组选择100 个分散良好的中期分裂相（染色体数为2n ±2 ）进行染色体畸变分析。对化妆品原料，则每一处理组选200 个（阳性对照可选100 个）分散良好的中期分裂相（染色体数为2n ±2 ）进行染色体畸变分析。在分析时应记录每一观察细胞的染色体数目，对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。 6.3 统计处理：对染色体畸变细胞率用X2 检验，以评价受试物的致突变性。 6.4 结果评价：在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中具有致突变性： （1）受试物引起染色体结构畸变数具有统计学意义，并有剂量相关性。

（2 ）受试物在任何一个剂量条件下，引起具有统计学意义的增加，并有可重复性。 在评价时应把生物学和统计学意义结合考虑。 7 试验报告

试验报告应包括以下内容：

（1）受试物名称、有关的理化性状、所用溶剂及其配制、剂量选择（应说明受试物对 细胞毒性的测定方法、溶解情况等）； （2 ）细胞株名称； （3 ）实验条件和方法

①代谢活化系统：制备S9时所用酶的诱导剂、选用的动物品种和来源、S9 mix 的配方； ②对照物：阳性对照物名称和选用浓度；阴性（溶剂）对照物名称及使用浓度。 ③培养液：所用培养液名称、血清类别和使用浓度； ④接种时的细胞密度以及所用培养皿（瓶）的规格； ⑤中期分裂阻断剂：名称、所用浓度、作用时间； ⑥处理时间：受试物与试验系统的接触时间；

⑦简述制片方法、分析的中期分裂相数目、结果评价方法。 （4 ）结果

①受试物最高剂量的确定及试验结果：细胞毒性的测定（建议的表格见表 1）；溶解情 况（建议的表格见表2 ）；对pH 和渗克分子（osmolality ）浓度的影响（如果有影响）。 ②各处理组和对照组染色体畸变率（建议的表格见表3 ）。

③本实验室的阳性对照组和阴性对照组（常用溶剂，如 DMSO ）在本实验室历史上的 染色体畸变率范围、均值和标准差（说明样品数）。 （5 ）结论。

8 结果解释

阳性结果表明受试物引起培养的哺乳动物体细胞染色体结构畸变。

阴性结果表明在本试验条件下，受试物不引起培养的哺乳动物体细胞染色体结构畸变。

十、体外哺乳动物细胞基因突变试验

In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test 1 范围

本规范规定了体外哺乳类细胞基因突变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。 2 规范性引用文件

GB15193 食品安全性毒理学评价程序和方法 15193.12 ；20⎯2003 OECD Guidelines for Testing of Chemicals （No.476 ，1997） 3 试验目的

该测试系统用于检测化妆品原料及其产品引起的突变，包括碱基对突变、移码突变和缺 失等，从而评价受试物引起突变的可能性。 4 定义

正向突变（Forward mutation ）：从原型至突变子型的基因突变，这种突变可引起酶和功能蛋白的改变。

突变频率（Mutant frequency ）：所观察到的突变细胞数与存活细胞数之比值。 5 试验原理

在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使细胞暴露于受试物一定时间，然后将细胞再 传代培养。胸苷激酶正常水平的细胞对三氟胸苷（trifluorothymidine ，TFT ）等敏感，因而在培养液中不能生长分裂，突变细胞则不敏感，在含有6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine，6-TG ）、8-azaguanine （AG ）或TFT 的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。基于突变集落数，计算突变频率以评价受试物的致突变性。 6 试验方法

6.1 试剂和受试物制备 6.1.1 受试物

6.1.1.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受 试物可以直接加入试验系统/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则就 必须证实储存不影响其稳定性。

6.1.1.2 溶剂的选择：溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活 和 S9 活性。首选溶剂是水或水溶性溶剂。二甲基亚砜（DMSO ）也是常用溶剂，但使用时 浓度不应大于0.5% 。 6.1.1.3 受试物浓度设置

6.1.1.3.1 最高浓度的选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解 度以及pH 或渗克分子浓度（osmolality ）的改变。

6.1.1.3.2 细胞毒性的确定：应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或 不存在两种条件下确定细胞毒性，例如相对集落形成率或相对细胞总生长情况（total growth ）。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。 6.1.1.3.3 剂量设置

至少应设置4 个可供分析的浓度。当有细胞毒性时，其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性。通常浓度间隔系数在2～ 10 之间。

如最高浓度是基于细胞毒性，那么该浓度组的细胞相对存活率（相对集落形成率）或相 对细胞总生长情况应为10%～20% （不低于10%）。

对于那些细胞毒性很低的化合物，最高浓度应是5µL/mL，5mg/mL 或0.0lmol/L 。 对于相对不溶解的物质，其最高浓度应达到或超过在细胞培养状态下的溶解度限值。最 好在试验处理开始和结束时均评价溶解度，因为由于 S9 等的存在，试验系统内在暴露过程中溶解度可能发生变化。不溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不应影响观察。

6.1.2 对照：在每一项试验中，在代谢活化系统存在和不存在的条件下均应设阳性对照和阴 性（溶剂）对照。

6.1.2.1 阳性对照：当使用代谢活化系统时，阳性对照物必须是要求代谢活化、并能引起突 变的物质。在没有代谢活化系统时，阳性对照物可使用甲磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate-EMS ，HPRT 试验）、甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate ，MMS ，TK试验），乙基亚硝基脲（ethyl nitrosourea-ENU，HPRT 试验）等。在有代谢活化系统时，可以使用 3- 甲基胆蒽（3-methylcholanthrene ，HPRT 试验；TK 试验）、环磷酰胺 （cyclophosphamide，TK 试验）N-亚硝基胍（N-nitroso-dimethylamine ，HPRT 试验）、7,12-二甲基苯蒽（HPRT 试验）等。也可使用其他适宜的阳性对照物。

6.1.2.2 阴性对照物：阴性对照（包括溶剂对照）除不含受试物外，其他处理应与受试物相 同。此外，当不具有实验室历史资料证实所用溶剂无致突变作用和无其他有害作用时，还应 设空白对照。

6.1.3 细胞：HPRT 位点突变分析常用中国仓鼠肺细胞株（V-79 ）和中国仓鼠卵巢细胞株

（CHO ）。TK 位点突变分析常用小鼠淋巴瘤细胞株（L5178Y ）和人类淋巴母细胞株（TK6 ）。 细胞在使用前应进行有无支原体污染的检查。

6.1.4 培养液：应根据实验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养基。对于 V-79 或 CHO细胞，常用 MEM（Eagle ）培养液加入 10%胎牛血清和适量抗菌素。对于 L5178Y 或 TK6细胞，常用RPMI 1640 培养液加入10%马血清和适量抗菌素。 6.1.5 活化系统：同体外哺乳类细胞染色体畸变试验。 6.1.6 选择剂：6-硫代鸟嘌呤（6-TG ）：建议使用终浓度为 5μg/mL～10μg/mL 。三氟胸苷（TFT ）：建议使用终浓度为3μg/mL 。 6.1.7 预处理培养液：THMG/THG

为减少细胞的自发突变率，在试验前，先将细胞加在含THMG 的培养液中培养24h ， 杀灭自发的突变细胞，然后将细胞再接种于THG （不含氨甲喋呤的THMG 培养液）中培养 1d～3d 。

-6 6.2 试验步骤

6.2.1 HPRT 位点突变分析

6.2.1.1 试验前 1d，接种细胞于培养瓶中，置于37°C 孵箱培养。

6.2.1.2 试验时吸去培养瓶中的培养液，加入一定浓度的受试物、S9 -mix （不加入S9 -mix 的样品，用培养液补足）及一定量的不含血清培养液，置孵箱中处理3h～6h 后，吸去培养液，用Hank’s 液洗细胞三次，加入含胎牛血清的培养液。

6.2.1.3 在受试物与细胞作用后当天和第3d 将细胞按低密度分种，在第7d 接种细胞，每个 剂量 3 瓶。7d 后染色以测定细胞存活率。另将一定数量细胞接种于每个培养瓶中，每个剂 量8 瓶，3h 后加入6-TG （终浓度为5μg/mL ），10d 后染色，计数突变细胞集落。 6.2.1.4 试验结果用X ２检验进行统计分析。

6.2.2 TK 位点突变分析（L5178Y 细胞，96 孔板法）

6.2.2.1 处理：取生长良好的细胞，调整密度为5×105/mL ，按1%体积加入受试物，37℃震摇处理3 小时。离心，弃上清液，用PBS 或不含血清的培养基洗涤细胞2 遍，重新悬浮细胞于含10%马血清的RPMI 1640 培养液中，并调整细胞密度为2×105/mL 。

6.2.2.2 PE0 （0 天的平板接种效率）测定：取适量细胞悬液，作梯度稀释至8 个细胞/mL ， 接种96 孔板（每孔加0.2mL，即平均1.6 个细胞/孔），每个剂量作1～2 块板，37℃，5% CO2 ， 饱和湿度条件下培养12d，计数每块平板有集落生长的孔数。

6.2.2.3 表达：步骤6.2.2.1 所得细胞悬液作2d 表达培养，每天计数细胞密度并保持密度在

以下。

7 结果评价

在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中为阳性结果：

（1）受试物引起突变频率具有统计学意义、并与剂量相关的增加。

（2 ）受试物在任何一个剂量条件下，引起具有统计学意义，并有可重复性的阳性反应。 阴性结果的判定需在%RS 达±20% （即已产生明显细胞毒性）的情况下未见突变频率显著增加时方可作出。在评价时应把生物学和统计学意义结合考虑。

阳性结果表明受试物可引起所用哺乳类细胞的基因突变。可重复的阳性剂量—反应关系 意义更大。

阴性结果表明在本试验条件下，受试物不引起所用哺乳类细胞的基因突变。 8 试验报告

试验报告应包括以下内容：

（1）受试物名称、有关的理化性状、所用溶剂及其配制、剂量选择（应说明受试物对 细胞毒性的测定方法、溶解情况等）； （2 ）细胞株名称； （3 ）实验条件和方法

①代谢活化系统：制备S9 时所用的诱导剂、动物品种和来源、S9 mix 的配方； ②对照物：阳性对照物名称和使用浓度；阴性（溶剂）对照物名称及使用浓度； ③培养液：所用培养液名称、血清类别和使用浓度； ④接种时的细胞密度以及所用培养瓶的规格； ⑤处理时间：受试物与实验系统的接触时间； ⑥表达时间； ⑦结果评价方法。 （4 ）结果

①受试物最高剂量的确定及结果：包括细胞毒性的测定；溶解情况；对pH 和渗克分子 浓度的影响（如果有影响）。

②试验结果：试验组和对照组的突变频率及统计结果。

③阳性对照组和阴性对照组（包括常用溶剂，如 DMSO ）在本实验室历史上的突变频 率范围、均值和标准差（说明样品数）。 （5 ）结论。

十一、哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验

In Vivo Mammalian Bone Marrow Cell Chromosome Aberration Test 1 范围

本规范规定了哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。

本规范适用于检测化妆品原料及其产品的遗传毒性。 2 规范性引用文件

OECD Guidelines for Testing of Chemicals （No.475 ，April 1997 ） 3 试验目的

本试验是一项致突变性试验，检测整体动物骨髓细胞染色体畸变，以评价受试物致突变 的可能性。 4 定义

染色体型畸变（Chromosome-type aberration ）：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。

染色单体型畸变（Chromatid-type aberration ）：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。

染色体数目改变（Numerical-type aberration ）：哺乳动物细胞染色体数目的改变。 5 试验基本原则

使哺乳动物（如大鼠或小鼠）经口或其它适宜途径染毒，动物处死前用细胞分裂中期阻 断剂处理，处死后制备骨髓细胞染色体标本，分析染色体畸变。 本方法特别适用于需考虑体内代谢活化后的染色体畸变分析。

若有证据表明待测物或其代谢产物不能到达骨髓，则不适用于本方法。 6 试验方法

6.1 实验动物和饲养环境：

选用健康成年啮齿类动物，推荐使用大鼠或小鼠，每组每种性别至少5 只，动物在实验室中至少应适应3～5 天，实验开始时每一性别动物的体重差异应控制在±20% 内。 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。 6.2 受试物

6.2.1 受试物配制：固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶剂中，并稀释至一定浓度。液体受 试物可直接使用或予以稀释。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必须证实贮存不影响其稳 定性。

6.2.2 溶剂的选择：溶剂在所选用浓度下，不引起毒性效应，不与受试物发生化学反应。首 选为水溶性溶剂。

6.2.3 剂量设置：应进行预试验以选择最高剂量。当有毒性时，可以引起死亡或者抑制骨髓 细胞有丝分裂指数（50% 以上）为指标确定最高剂量。在第一次采集样品时，需设置3 个可供分析的剂量，在第二次采集样品时，则仅需设置最高剂量组。

如果一次剂量为2000mg/kg 体重时仍未引起毒性效应，则只设2000mg/kg 体重剂量组。 如果人类的可能（期望）暴露量过大，可选择 2000mg/kg/BW/d染毒 14 天，或选择 1000mg/kg/BW/d 染毒大于14 天进行试验。

6.3 对照：在每项试验中，对每种性别均应设阴性对照组和阳性对照组。除不使用受试物 外，其它处理与受试物组一致。

6.3.1 阴性对照：除设溶剂对照（即仅含溶剂）外，如果没有文献资料或历史性资料证实所 用溶剂不具有有害作用或致突变作用，还应设空白对照组。

6.3.2 阳性对照：阳性对照物应能引起染色体结构畸变率明显高于背景资料。染毒途径可以 不同于受试物。所选用的阳性对照物最好与受试物类别有关。可以使用下述物质：三亚乙基 密胺（triethylenemelamine ）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate ）、乙基亚硝基脲（ethyl nitrosonrea ）、丝裂霉素C （mytomycin C ）和环磷酰胺（cyclophosphamide ）。 6.4 染毒方式：可采用经口或其它适宜的染毒方式。一般染毒为一次完成，如剂量过大时， 一天内染毒数次也是可以的，但每次应间隔数小时。

一般情况下，染毒 1 次，但分两次采集标本,即每组动物分两个亚组，亚组 1 于染毒后12h～18h 处死并采集第一次标本；亚组2 于亚组1 处死后24h 采集第二次标本。如果采用多次染毒，于末次染毒后12h～18h 采集标本。于处死动物采集标本前腹腔注射细胞分裂中期阻断剂（如用秋水仙素，于处死前4h ，按4mg/kg 体重给药。若使用动物为小鼠，适宜的处理时间为3h～5h，若使用动物为中国仓鼠，适宜的处理时间为4h～5h ）。 6.5 试验步骤

6.5.1 用颈椎脱臼法处死动物，取出股骨，剔除肌肉等组织。

6.5.2 剪去股骨两端，用注射器吸取5mL 生理盐水，从股骨一端注入，用 10mL 离心管， 从股骨另一端接取流出的骨髓细胞悬液。

6.5.3 将细胞悬液以 1000rpm 的速度离心5min～7min，去除上清液。

6.5.4 加入0.075mol/L KCl 溶液7mL，用滴管将细胞轻轻地混匀，放入37℃水浴中低渗处 理7min，加入1mL～2mL 固定液（冰醋酸：甲醇=1 ：3 ），混匀，以1000rpm 速度离心5min～ 7min，弃去上清液。

6.5.5 加入7mL 固定液，混匀，固定15min，以1000rpm 的速度离心7min，弃去上清液。 6.5.6 用同法再固定1～2 次，弃去上清液。 6.5.7 加入数滴新鲜固定液，混匀。

6.5.8 用混悬液滴片，以空气干燥或火焰干燥法制片。 6.5.9 用姬姆萨染液染色。 6.6 读片和结果处理

6.6.1 确定有丝分裂指数：包括所有处理组、阳性和阴性对照组（每只动物计数 500～1000 个细胞）。

6.6.2 计数畸变细胞：对每只动物至少选择100 个分散良好的中期分裂相，在显微镜油镜下进行读片。由于低渗等机械作用的破坏，会导致处于中期的染色体发生丢失，所以，观察的中期相染色体数目应控制在2n ±2 内。在读片时应记录每一观察细胞的染色体数目，对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。裂隙（Gap ）应单独记录并列出，通常不作为

2

染色体结构畸变计算。所得各组的染色体畸变率用X检验等进行统计学处理，以评价试验组和对照组之间是否有显著差异。 6.7 结果评价

每个动物作为一个试验单位，在统计分析时，每个动物的数据应列表进行。可把结构畸 变细胞率（% ）和每细胞内的染色体畸变数作为评价指标。统计分析的标准有几个，当受试 物引起染色体畸变数具有统计学意义，并有与剂量相关的增加或者在一个剂量组、单一时间 采样的试验中出现染色体畸变细胞数明显增高，则判定具有致突变性。

在评价时应综合考虑生物学意义和统计学意义，不能作出明确结论时，应改变试验条件 进一步进行测试。 7 试验报告

报告应包括下列项

（1）受试物名称、理化性质、所用溶剂及配制；

（2 ）动物种属和品系、体重、数量、性别、来源（注明合格证号和动物级别）； （3 ）实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物房合格证号； （4 ）剂量和组别：选择剂量的原则、剂量和组别、阴性和阳性对照物及剂量；

（5 ）试验条件和方法：染毒途径和染毒方案、细胞毒性测定方法、所用的细胞分裂中期阻断剂及其剂量和采样时间、简述制备染色体的方法； （6 ）观察和分析的细胞数； （7 ）畸变类型和数量及畸变率；

（8 ）结论。 8 结果解释

阳性结果证明受试物具有引起该种受试动物骨髓细胞染色体畸变的能力。

阴性结果表明在本试验条件下受试物不引起该种受试动物骨髓细胞染色体畸变。

十二、体内哺乳动物细胞微核试验

Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test 1 范围

本规范规定了哺乳动物红细胞微核试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于化妆品原料的染色体畸变检测。 2 规范性引用文件

GB14924 实验动物与饲料标准

OECD Guidelines for Testing of Chemicals （No.474 ，Adopted ：21 ，July 1997 ） 3 定义

微核（Micronucleus ）：染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。 4 原理

凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物，都可用微核试验来检 测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核叶及核的突起 难以鉴别。嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段，此时红 细胞的主核已排出，因胞质内含有核糖体，姬姆萨染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消 失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核容易辨认，而且微核自发率低， 因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。

若动物染毒的时间达4 周以上，也可选同一终点的外周血正染红细胞进行微核试验。 若有证据表明待测物或其代谢产物不能到达骨髓，则不适用于本方法。 5 试验的基本原则

通过适当的途径使动物接触受试物，一定时间后处死动物，取出骨髓（或外周血），制 备涂片，经固定、染色，在显微镜下计数含微核的嗜多染红细胞（红细胞）。 6 仪器和器械

生物显微镜、解剖剪、镊子、止血钳、注射器、灌胃针头、载玻片、盖玻片（24mm × 50mm ）、塑料吸瓶、纱布、滤纸等。 7 试剂

7.1 小牛血清（灭活）

将滤菌的小牛血清置于 56℃恒温水浴保温30min 灭活。灭活的小牛血清通常保存于冰 箱冷冻室里。

7.2 姬姆萨（Giemsa ）染液

成分：姬姆萨染料 3.8g 甲醇 375mL 甘油 125mL

配制：将染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375mL 和甘油，混合均匀， 放置37℃恒温箱中保温48h 。保温期间，振摇数次，促使染料的充分溶解，取出过滤，两周后用。

8 实验动物和饲养环境

适宜的哺乳动物均适用于本实验，推荐使用小鼠或大鼠。小鼠是微核试验的常规动物。 体重为25g～30g 。也可选用成年大鼠，体重为150g～200g 。动物在实验室中至少应适应3～5d，实验开始时每一性别动物的体重差异应控制在±20% 内 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。 9 剂量分组

一般取受试物LD50 的1/2、1/5、1/10、1/20 等剂量，以求获得微核的剂量-反应关系曲线。当受试物的LD50 大于5g/kg 体重时，可取5g/kg 体重为最高剂量，一般至少设3 个剂量。每个剂量组 10 只动物，雌、雄性各半。另外，还应设溶剂对照和阳性物对照组。常用环磷酰胺作为阳性物对照，剂量可为40mg/kg 体重。

如果人类的可能（期望）暴露量过大，可选择 2000mg/kg/BW/d 染毒 14 天，或选择 1000mg/kg/BW/d 染毒大于14 天进行试验。

根据受试物的理化性质（水溶性和/或脂溶性）确定受试物所用的溶剂，通常用水、植 物油或食用淀粉等。 10 染毒途径和方式

染毒途径视实验目的而定，建议采用经口灌胃方式。采用30h 两次给药法，即两次给受试物间隔24h ，第二次给受试物后6h 取材。 11 试验方法 11.1 样本的制取

动物颈椎脱臼处死后，打开胸腔，沿着胸骨柄与肋骨交界处剪断，剥掉附着其上的肌肉， 擦净血污，横向剪开胸骨，暴露骨髓腔，然后用止血钳挤出骨髓液。

长时间染毒的外周血样本从尾或耳静脉采血，一般应在未次染毒的18～24h、36～48h 之间分两次进行。 11.2 涂片

将骨髓液（外周血）滴在载玻片一端的小牛血清液滴里，仔细混匀。一般来讲，两节胸 骨髓液涂一张片子为宜。然后，按血常规涂片法涂片，长度约2cm～3cm 。在空气中晾干。 若立即染色，需在酒精灯火焰上方，稍微烘烤一下。

11.3 固定

将干燥的涂片放入甲醇液中固定5min 。即使当日不染色，也应固定后保存。 11.4 染色

将固定过的涂片放入Giemsa 应用液中，染色10min～15min，然后立即用1/15mol/L 磷 酸盐缓冲液冲洗。 11.5 封片

用滤纸及时擦干染片背面的水滴，再用双层滤纸轻轻按压染片，以吸附染片上残留的水 分，再在空气中晃动数次，以促其尽快晾干，然后放入二甲苯中透明 5min，取出滴上适量

光学树脂胶，盖上盖玻片，写好标签。 11.6 观察与计数

先用低倍镜，后用高倍镜粗略检查，选择细胞分布均匀，细胞无损，着色适当的区域， 再在油浸镜下计数。虽然不计数含微核的有核细胞，但需用有核细胞形态染色完好做好判断 制片优劣的标准。

本法观察含微核的红细胞。嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈淡桔红色。微核大多 数呈单个圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质相一致，呈紫红色或蓝紫色。 每只动物至少计数2000 个嗜多染红细胞（红细胞）。微核率指含有微核的红细胞数，以 千分率（‰）表示之。若一个嗜多染红细胞中出现两个或两个以上微核，仍按一个有微核细胞计数。

经过化妆品标准委员会验证或证实的图像自动分析系统与流式细胞仪进行的微核试验， 可接受为本方法的替代试验。 12 数据处理和结果判断 12.1 数据处理

报告各组微核细胞率的均数和标准差，利用适当的统计学方法如 Poinsson 分布u 检验比较受试物各剂量组与溶剂对照组的微核率。

若无证据表明所得的数据有性别间的差异，则可将两性别的数据合并进行统计分析。 12.2 结果判定

在评价时应综合考虑生物学意义和统计学意义，如果受试物试验组与溶剂对照组相比， 单一剂量法微核率有明显增高；多剂量法的剂量组在统计学上有显著性差异，并有剂量—反 应关系则可认为微核试验阳性。 13 试验报告

试验报告应包括以下内容：

（1）受试物名称、理化性状、配制方法、所用溶剂；

（2 ）动物种属和品系、体重、数量、性别、来源（注明合格证号和动物级别）； （3 ）实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物室合格证号； （4 ）剂量分组，染毒途径和方式；

（5 ）试验方法：简述操作步骤，所用统计学方法，结果判定标准； （6 ）结果：以列表方式报告受试物对动物骨髓细胞微核发生率（表1）； （7 ）结论。

十三、睾丸生殖细胞染色体畸变试验

Testicle Cells Chromosome Aberration Test

1 范围

本规范规定了哺乳动物睾丸初级精母细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于化妆品原料的遗传毒性检测。 2 规范性引用文件

GB15193 食品安全性毒理学评价程序和方法GB15193.8—2003 3 试验目的

检测雄性动物生殖细胞染色体损伤，以评价受试物致突变的可能性。 4 试验的基本原则

通过适当的途径使动物接触受试物，一定时间后处死动物，动物处死前用细胞分裂中期 阻断剂处理，处死后制备睾丸初级精母细胞染色体标本，在显微镜下观察染色体畸变。 本方法特别适用于需考虑体内代谢活化后的染色体畸变分析。

若有证据表明待测物或其代谢产物不能到达睾丸，则不适用于本方法。 5 仪器和器械

生物显微镜、离心机、解剖剪、镊子、离心管、平皿、注射器、灌胃针头、载玻片、盖 玻片（24mm ×50mm ）等。 6 试剂

6.1 0.04%秋水仙素：取40mg 秋水仙素，加生理盐水至100mL。 6.2 1 ％柠檬酸三钠：取1g 柠檬酸三钠，加蒸馏水至100mL。

6.3 0.075mol/L 氯化钾溶液：取氯化钾5.59g，加蒸馏水至1000mL。 6.4 甲醇/冰醋酸（3 ：1，v/v ）固定液：临用现配。

6.5 60 ％冰乙酸：取60mL 冰乙酸，加蒸馏水至100mL，均宜新鲜配制。 6.6 pH6.8 磷酸盐缓冲液。

6.6.1 1/15mol/L磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠（Na2 HPO4）9.47 g，加蒸馏水至1000mL。

6.6.2 l/15mol/L 磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾（KH2 PO4）9.07g，加蒸馏水至1000mL。 6.6.3 将磷酸氢二钠溶液50mL 与磷酸二氢钾溶液50mL 混合。 6.7 姬姆萨染液。

6.7.1 姬姆萨储备液：取姬姆萨染料3.8g，置玛瑙乳钵中，加少量甲醇研磨，逐渐加甲醇至375mL 。溶解后再加125mL 纯甘油，于37℃温箱保温48h ，在此期间摇动数次，放置1～2 周过滤备用。

6.7.2 姬姆萨应用液：取lmL 储备液加入10mL pH6.8 磷酸缓冲液。 6.8 生理盐水、甲醇。 7 实验动物和饲养环境

适宜的雄性啮齿类动物均适用于本实验。推荐使用小鼠，6 周～8 周龄，体重为 30g～ 35g 。动物在实验室中至少应适应5 天，实验开始时动物的体重差异应控制在±20% 内。 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。 8 剂量分组

受试物至少设三个剂量组。分别取 1/2、1/5、1/10 或 1/20LD50 剂量。当受试物的LD50大于5g/kg 体重时，可取5g/kg 体重为最高剂量。另外设阴性（溶剂）对照组和阳性物对照组。阳性对照组用环磷酰胺（40mg/kg 体重）或丝裂霉素C （1.5mg/kg 体重～2mg/kg 体重），腹腔注射。每组至少有5 只存活动物。

根据受试物的理化性质（水溶性和/或脂溶性）确定受试物所用的溶剂，通常用水、植 物油或食用淀粉等。 9 染毒途径和方式

染毒途径视实验目的而定，建议采用经口灌胃方式。每天1 次染毒（如剂量过大时，一 天内染毒数次也是可以的，但每次应间隔数小时），连续5d 。于第1 次染毒后的第12d～14d将受试动物处死。处死动物前6h，腹腔注射0.04%秋水仙素溶液，剂量为4mg/kg 体重。 10 试验方法 10.1 取材

取出两侧睾丸，去净脂肪，于生理盐水中洗去毛和血污，放入盛有适量1％柠檬酸三钠 或0.075mol/L 氯化钾溶液的小平皿中。 10.2 制片

10.2.1 低渗：以眼科镊撕开被膜，轻轻地分离曲细精管，室温下低渗，低渗时间视温度等 具体条件而定，一般在15min～25min 。

10.2.2 固定：仔细吸尽低渗液，加固定液（甲醇：冰乙酸＝3 ∶1）10mL 固定。第一次不超过15min，倒掉固定液后，再加入新的固定液固定20min 以上。

10.2.3 离心：吸尽固定液，加60 ％冰乙酸1mL～2mL ，待大部分曲细精管软化完后，立即 加入倍量的固定液，打匀、移入离心管，以1000rpm 的速度离心10min，再固定一次。 10.2.4 滴片：弃去大部分上清液，留下约0.5mL～1.0mL，充分打匀制成细胞混悬液，将细 胞混悬液均匀地滴于冰水玻片上，空气干燥或火焰干燥法制片。

10.2.5 染色：用1：10 姬姆萨染液（pH6.8 ）染色20min～40min 。 10.3 封片

用滤纸及时擦干染片背面的水滴，再用双层滤纸轻轻按压染片，以吸附染片上残留的水 分，再在空气中晃动数次，以促其尽快晾干，然后放入二甲苯中透明 5min，取出滴上适量 光学树脂胶，盖上盖玻片，写好标签。 10.4 阅片

10.4.1 阅片要求

在低倍镜下按顺序寻找背景清晰、分散良好、染色体收缩适中的中期分裂相，然后在 油镜下进行分析。由于低渗等机械作用的破坏，会导致处于中期的染色体发生丢失，所以， 观察的中期相染色体数目应是n 对双价体，每只动物至少分析100 个中期分裂相的初级精母细胞。对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。 10.4.2 观察项目

10.4.2.1 染色体结构的改变

10.4.2.1.1 断裂：损伤长度大于染色体的宽度。 10.4.2.1.2 微小体：较断片小而呈圆形。

10.4.2.1.3 多价体：在减数分裂时，染色体相互易位能产生环状的多价体，或链状多价体。 在对照成年动物中自发易位率极低，低于0.01 ％。老年动物可稍有增加。 10.4.2.2 X-Y 和常染色体的单价体

X-Y 和常染色体的单价体亦称早熟分离。对照动物X-Y 单价体较常见，约有0～10％。 因X 和Y 染色体是长臂的远端，非同源的片段相接。X 、Y 的分离常可引起不育。常染色体的单价体是由于不联会（同源片段间配对合子的缺失），或联会消失（由于交叉失败而分离）而造成，它们在对照组动物中较少见，因为交叉在双线期形成，正常配对的联合一直到中期Ⅰ末。常发生于最小一对常染色体中。 11 数据处理和结果判断

将染色体结构畸变细胞率（% ）、X-Y 和常染色体的单价体分别计算。用X2 检验或其他适当的显著性检验方法进行统计学处理。当各剂量组与阴性（溶剂）对照组相比，畸变细胞率有显著性意义的增加，并有剂量-反应关系时；或仅一个剂量组有显著性意义的增加，并具可重复性，可判为试验结果阳性。

在评价时应综合考虑生物学意义和统计学意义。不能做出明确结论时，应改变试验条件 进一步进行测试。 12 试验报告

试验报告应包括以下内容：

（1）受试物名称、理化性状、配制方法、所用溶剂及配制；

（2 ）动物种属和品系、体重、数量、来源（注明合格证号和动物级别）；

（3 ）实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物室合格证号； （4 ）剂量和组别：剂量选择的原则、剂量和组别、阴性和阳性对照物及剂量；

（5 ）试验条件和方法：染毒途径和染毒方案、所用的细胞分裂中期阻断剂及其剂量和 采样时间、简述染色体制备的方法、所用统计学方法； （6 ）观察和分析的细胞类型和细胞数； （7 ）畸变类型和数量及畸变率； （8 ）结论。 13 结果解释

阳性结果证明受试物具有引起该种动物睾丸生殖细胞染色体畸变的能力。

阴性结果表明在本试验条件下受试物不引起该种动物睾丸生殖细胞染色体畸变。

十四、亚慢性经口毒性试验

Subchronic Oral Toxicity Test 1 范围

本规范规定了啮齿类动物亚慢性经口毒性试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料的亚慢性经口毒性。 2 规范性引用文件

OECD Guidelines for Testing of Chemicals （No.408 ，Sep. 1998） 3 试验目的

在估计和评价化妆品原料的毒性时，获得受试物急性毒性资料后，还需进行亚慢性经口 毒性试验。通过该试验不仅可获得一定时期内反复接触受试物后引起的健康效应、受试物作 用靶器官和受试物体内蓄积能力资料，并可估计接触的无有害作用水平，后者可用于选择和 确定慢性试验的接触水平和初步计算人群接触的安全性水平。 4 定义

4.1 亚慢性经口毒性（Subchronic oral toxicity）

是指在实验动物部分生存期内，每日反复经口接触受试物后所引起的不良反应。 4.2 无有害作用水平（No-adverse-effect level ）

是指在试验中不引起任何有害作用的最大染毒剂量，可用每日单位动物体重接触受试物 的重量（mg/kg ）表示。当受试物是混入动物饲料或饮水中进行染毒时，可用每公斤饲料或 每毫升饮水中受试物重量（mg/kg ，mg/mL ）表示。 5 试验的基本原则

以不同剂量受试物每日经口给予各组实验动物，连续染毒90d，每组采用一个染毒剂量。 染毒期间每日观察动物的毒性反应。在染毒期间死亡的动物要进行尸检。染毒结束后所有存 活的动物均要处死，并进行尸检以及适当的病理组织学检查。 6 试验方法

6.1 实验动物和饲养环境

6.1.1 动物种系的选择

常规选择啮齿类动物，首选大鼠。一般选用6 周～8 周龄的大鼠。动物体重的变动范围不应超出平均动物体重的 10%。若该试验为慢性试验的预备试验，则在两个试验中所用的 动物种系应当相同。 6.1.2 动物的性别和数量

每一剂量组实验动物至少应有20 只（雌雄各半），但是考虑到亚慢性试验的重要性，应适当增加每组雌雄动物数。若计划在试验过程中处死动物，则应增加计划处死的动物数。试验结束时的动物数需达到能够有效评价受试物毒性作用的数量。此外，可另设一追踪观察组，选用20 只动物（雌雄各半），给予最高剂量受试物，染毒90d，在全程染毒结束后继续观察一段时间（一般不少于28d ），以了解毒性作用的持续性、可逆性或迟发毒作用。 6.1.3 饲养环境

实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用常规饲料，饮水不限制。 6.2 剂量分组

试验时至少要设三个染毒组和一个对照组。除不接触受试物外，对照组的其它条件均与 试验组相同。最高染毒剂量的设计应在引起中毒效应的前提下又不致造成动物过多死亡，否 则将会影响结果的评价。低剂量组应不出现任何毒性作用。若掌握人群接触水平，则最低染 毒剂量应高于人群的实际接触水平。中间剂量组应引起较轻的可观察到的毒性作用。若设多 个中间剂量组，则各组的染毒剂量应引起不同程度毒性作用。在中、低剂量组和对照组中， 动物死亡率应很低，以保证得到有意义的评价结论。

对那些毒性较低的物质来说，当通过饲料染毒时应特别注意确保大量的受试物混入不会 对动物正常营养产生影响。对其它的染毒方式要加以特殊说明。若采用灌胃方式染毒，则每 日染毒时点应相同，并定期（每周）按体重调整染毒剂量，维持单位体重染毒水平不变。 本项试验中，如果接触水平超过1000mg/kg 时仍未产生可观测到的毒性效应，而且可以 根据相关结构化合物预期受试物毒性时，可以考虑不必进行三个剂量水平的全面试验观察。 6.3 试验步骤

染毒开始前至少要有5d 时间使实验动物适应实验室饲养环境。实验动物随机分组。受 试物可通过混入饲料或饮水、直接喂饲以及灌胃进行染毒。动物每周7d 染毒。试验期间所 有动物染毒的方式应完全相同。若为染毒目的加入其它溶剂或添加剂，这些溶剂或添加剂不 应影响受试物的吸收或引起毒性作用。 6.4 临床观察

观察时间应至少为90d 。追踪观察组还要增加28d ，但不作任何处理，以了解毒性作用的可逆性、持续性及迟发毒作用。

观察期间对动物的任何毒性表现均应记录，记录内容包括发生时间、程度和持续时间。 观察应至少包括如下内容：皮肤和被毛的改变、眼和粘膜变化、呼吸、循环、植物神经和中 枢神经系统、肢体运动和行为活动等改变。应计算每周饲料消耗量（或当通过饮水染毒时的 饮水消耗量），记录每周体重变化。 6.5 临床检查 6.5.1 眼科检查

在动物染毒前和染毒后，最好对所有实验动物，至少应对最高剂量组和对照组动物，使 用眼科镜或其它有关设备进行眼科检查。若发现动物有眼科变化则应对所有动物进行检查。 6.5.2 血液检查

在染毒前、染毒中期、染毒结束及追踪观察结束时应测定血球容积、血红蛋白浓度、红 细胞数、白细胞总数和分类，必要时测定凝血功能如凝血时间、凝血酶原时间、凝血激酶时 间或血小板数等指标。

6.5.3 临床血液生化检查

在染毒前、染毒中期、染毒结束及追踪观察结束时进行，检查指标包括电解质平衡、碳 水化合物代谢、肝、肾功能。可根据受试物作用形式选择其它特殊检查。推荐的指标包括： 钙、磷、氯、钠、钾、禁食血糖（不同动物品系采用不同的禁食期）、血清谷丙转氨酶、血 清谷草转氨酶、鸟氨酸脱羧酶、γ谷氨酰转肽酶、尿素氮、白蛋白、血液肌酐、总胆红素及总血清蛋白。必要时可进行脂肪、激素、酸碱平衡、正铁血红蛋白、胆碱酯酶活性的分析测定。此外，还可根据所观察到的毒性作用进行其它更大范围的临床生化检查，以便进行全面的毒性评价。

6.5.4 尿液检查

一般不需要进行，只有当怀疑存在或观察到相关毒性作用时方需进行尿液检查。 6.6 病理检查 6.6.1 大体尸检

所有动物均应进行全面的大体尸检，内容包括动物的外观、所有孔道，胸腔、腹腔及其 内容物。肝、肾、肾上腺、睾丸、附睾、子宫、卵巢、胸腺、脾、脑和心脏应在分离后尽快 称重以防水分丢失。应将下列组织和器官保存在固定液中，以备日后进行病理组织学检查： 所有大体解剖呈现异常的器官、脑（包括延髓/脑桥、小脑和大脑皮层、脑垂体）、甲状腺/ 甲状旁腺、胸腺、肺/气管、心脏、主动脉、唾液腺*、肝、脾、肾、肾上腺、胰、性腺、子 宫、生殖附属器官*、皮肤*、食管、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、膀胱、 前列腺、有代表性的淋巴结、雌性乳腺*、大腿肌肉*、周围神经、胸骨（包括骨髓）、眼*、 股骨（包括关节面）*、脊髓（包括颈部、胸部、腰部）*和泪腺*。

*只有当毒性作用提示或作为被研究的靶器官时才需要检查这些器官。 6.6.2 病理组织学检查

应对下述器官和组织进行检查：

（1）所有最高剂量组和对照组动物的重要的和可能受到损伤的器官或组织，如高剂量 组动物的器官或组织有病理组织学的病变，则应扩展至其它剂量组的相应的器官和组织。 （2 ）各剂量组大体解剖见有异常的器官或组织。 （3 ）其它剂量组动物的靶器官。

（4 ）在追踪观察组，应对那些在染毒组呈现毒性作用的组织和器官进行检查。 7 试验结果的评价 7.1 结果的处理

可通过表格形式总结试验结果，显示试验开始时各组动物数、出现损伤的动物数、损伤 的类型和每种损伤的动物百分比。对所有数据应采用适当的统计学方法进行评价，统计学方 法应在试验设计时确定。 7.2 试验结果的评价

亚慢性经口毒性试验结果应结合前期试验结果，并考虑到毒性效应指标和尸检及病理组 织学检查结果进行综合评价。毒性评价应包括受试物染毒剂量与是否出现毒性反应、毒性反 应的发生率及其程度之间的关系。这些反应包括行为或临床异常、肉眼可见的损伤、靶器官、 体重变化情况、死亡效应以及其它一般或特殊的毒性作用。成功的亚慢性试验应能够提出统 计学上有意义的无有害作用水平。 7.3 试验报告

试验报告应包括如下内容：

（1）受试物名称、理化性状、配制方法、所用浓度；

（2 ）实验动物的种属、品系和来源（注明合格证号和动物级别）；

（3 ）实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、单笼饲养或群饲、实验动物

房合格证号；

（4 ）试验方法；

（5 ）按性别和剂量的毒性反应数据；

（6 ）在试验期间动物死亡的时间或动物在染毒结束时是否存活； （7 ）毒性作用或其它作用；

（8 ）观察到的每个异常症状的时间及其转归情况； （9 ）食物摄入量和动物体重资料； （10）眼科检查结果； （11）血液学检查结果； （12）临床生化检查结果； （13）尸检所见；

（14）病理组织学检查所见的详细描述； （15）对结果进行处理的统计学方法； （16）结论。 8 试验结果的解释

亚慢性经口毒性试验能够提供受试物在经口反复接触时的毒性作用资料。其试验结果可 在很有限的程度上外推到人，但它可为确定人群暴露的无有害作用水平和允许暴露水平提供 有用的信息。

十五、亚慢性经皮毒性试验

Subchronic Dermal Toxicity Test 1 范围

本规范规定了啮齿类动物亚慢性经皮毒性试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料的亚慢性经皮毒性。 2 规范性引用文件

OECD Guidelines for Testing of Chemicals （No.411 ，May 1981 ） 3 试验目的

在估计和评价化妆品原料的毒性时，获得受试物急性经皮毒性资料后，还需进行亚慢性 经皮毒性试验。通过该试验不仅可获得在一定时期内反复接触受试物后可能引起的健康影响 资料，而且为评价受试物经皮渗透性、作用靶器官和慢性皮肤毒性试验剂量选择提供依据。 4 定义

4.1 亚慢性经皮毒性（Subchronic dermal toxicity）

是指在实验动物部分生存期内，每日反复经皮接触受试物后所引起的不良反应。 4.2 无有害作用水平（No-adverse-effect level ）

是指在试验中不引起任何有害作用的最大染毒剂量。用每日每单位动物体重给予受试物 的重量（mg/kg ）表示。 5 试验的基本原则

以不同剂量受试物每日经皮给予各组实验动物，连续染毒90d，每组采用一个染毒剂量。 染毒期间每日观察动物的毒性反应。在染毒期间死亡的动物要进行尸检。染毒结束后对所有 存活的动物均要处死，并进行尸检以及适当的病理组织学检查。 6 试验方法 6.1 受试物

若受试物为固体，应将其粉碎并用水（或适当的介质）充分湿润，以保证受试物与皮肤 有良好的接触。若采用介质，应考虑该介质对受试物皮肤通透性的影响。液体受试物一般不

用稀释。

6.2 实验动物和饲养环境 6.2.1 动物种系的选择

可采用成年大鼠、家兔或豚鼠进行试验，也可使用其它种属的动物。当亚慢性试验作为 慢性试验的预备试验时，则在两项试验中所使用的动物种系应当相同。 6.2.2 动物的性别和数量

每一剂量组实验动物至少应有20 只（雌雄各半），皮肤健康。若计划在试验过程中处死动物，则应增加计划处死的动物数。此外，可另设一追踪观察组，选用20 只动物（雌雄各半），给予最高剂量受试物，染毒90d，全程染毒结束后继续观察一段时间（一般不少于28d ），以了解毒性作用的持续性、可逆性或迟发毒作用。 6.2.3 饲养环境

实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用常规饲料，饮水不限制。 6.3 剂量分组

试验时至少要设三个染毒组和一个对照组。除不接触受试物外，对照组的其它条件均与 试验组相同。最高染毒剂量的设计应在引起中毒效应的前提下又不致造成动物过多死亡，否 则将会影响结果的评价。低剂量组应不出现任何毒性作用。若掌握人群接触水平，则最低染 毒剂量应高于人群的实际接触水平。中间剂量组应引起较轻的可观察到的毒性作用。若设多 个中间剂量组，则各组的染毒剂量应引起不同程度毒性作用。在中、低剂量组和对照组中， 动物死亡率应很低，以保证得到有意义的评价结论。

若受试物引起严重的皮肤刺激效应，则应降低受试物的使用浓度，尽管这样可导致原来 在高剂量下出现的其它毒性作用减弱或消失。若在试验早期动物的皮肤受到严重损伤，则有 必要终止试验，并使用较低的浓度重新开始试验。 本项试验中，如果接触水平超过1000mg/kg 时仍未产生可观测到的毒性效应，而且可以 根据相关结构化合物预期受试物毒性时，可以考虑不必进行三个剂量水平的全面试验观察。 6.4 试验步骤

动物在试验前至少要在实验室饲养环境中适应 5d 时间。染毒前24h ，将动物躯干背部染毒区的被毛剪掉或剃除。大约每周要对染毒部位去毛。在使用剪刀或剃刀进行去毛时应特别小心，以防损伤动物的皮肤从而引起皮肤通透性的改变。染毒部位的面积不应小于动物体表面积的 10%，应通过对动物体重的测定确定染毒部位的面积。若受试物毒性较大，则可

相对减小染毒区域的面积，但受试物应尽可能薄而均匀地涂敷于整个染毒区域。在染毒操作 期间应使用玻璃纸和无刺激的胶带将受试物固定，以保证受试物与皮肤有良好的接触，并防 止动物舔食。

在90d 试验期间，实验动物每周7d 每天染毒6h 。追踪观察组则要多进行28d 观察，以了解毒性作用的持续性、可逆性及迟发毒作用。 6.5 临床观察

试验中每天至少应进行一次仔细的临床检查。

观察期间对动物的任何毒性表现均应记录，记录内容包括发生时间、程度和持续时间。 笼边观察应至少包括如下内容：皮肤和被毛的改变、眼和粘膜变化、呼吸、循环、植物神经 和中枢神经系统、肢体运动和行为活动等改变。应计算每周饲料消耗量，记录每周体重变化。 6.6 临床检查 6.6.1 眼科检查

在动物染毒前和染毒后，最好对所有实验动物，至少应对最高剂量组和对照组动物，使 用眼科镜或其它有关设备进行眼科检查。若发现眼科变化则应对所有动物进行检查。 6.6.2 血液检查

在染毒前、染毒中期、染毒结束及追踪观察结束时应测定包括血球容积、血红蛋白浓度、 红细胞数、白细胞总数和分类、必要时测定凝血功能，如凝血时间、凝血酶原时间、凝血激 酶时间或血小板数等指标。 6.6.3 临床血液生化检查

染毒前、染毒中期、染毒结束及追踪观察结束时进行，检查指标包括电解质平衡、碳水化合物代谢、肝、肾功能。可根据受试物作用形式选择其它特殊检查。推荐的指标包括：钙、 磷、氯、钠、钾、禁食血糖（不同动物品系采用不同的禁食期）、血清谷丙转氨酶、血清谷 草转氨酶、鸟氨酸脱羧酶、γ谷氨酰转肽酶、尿素氮、白蛋白、血液肌酐、总胆红素及总血清蛋白。必要时可进行脂肪、激素、酸碱平衡、正铁血红蛋白、胆碱酯酶活性的分析测定。 此外，还可根据所观察到的毒性作用进行其它更大范围的临床生化检查，以便进行全面的毒 性评价。

6.6.4 尿液检查

一般不需要进行，只有当怀疑存在或观察到相关毒性作用时方需进行尿液检查。 6.7 病理检查 6.7.1 大体尸检

所有动物均应进行全面的大体尸检，内容包括机体的外观、所有孔道，胸腔、腹腔及其 内容物。肝、肾、肾上腺和睾丸、附睾、子宫、卵巢、胸腺、脾、脑和心脏应在分离后尽快 称重以防水分丢失。应将下列组织和器官保存在固定液中，以便日后进行病理组织学检查： 所有大体解剖呈现异常的器官、脑（包括延髓/脑桥、小脑和大脑皮层、脑垂体）、甲状腺/ 甲状旁腺、胸腺、肺/气管、心脏、主动脉、唾液腺*、肝、脾、肾、肾上腺、胰、性腺、子 宫、生殖附属器官*、皮肤*、食管、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、膀胱、 前列腺、有代表性的淋巴结、雌性乳腺*、大腿肌肉*、周围神经、胸骨（包括骨髓）、眼*、 股骨（包括关节面）*、脊髓（包括颈部、胸部、腰部）*和泪腺*。

*只有当毒性作用提示或作为被研究的靶器官时才需要检查这些器官。 6.7.2 病理组织学检查

应对下述器官和组织进行病理组织学检查：

（1）所有最高剂量组和对照组动物的重要的和可能受到损伤的器官或组织，如高剂量 组动物的器官或组织有病理组织学病变则应扩展至其他剂量组的相应的器官和组织。 （2 ）各剂量组大体解剖见有异常的器官或组织。 （3 ）其它剂量组动物的靶器官。

（4 ）对追踪观察组，应对那些在染毒组呈现毒性作用的组织和器官进行检查。 7 试验结果的评价 7.1 结果的处理

可通过表格形式总结试验结果，显示试验开始时各组动物数、出现损伤的动物数、损伤 的类型和每种损伤的动物百分比。对所有数据应采用适当的统计学方法进行评价，统计学方 法应在试验设计时确定。 7.2 试验结果的评价

亚慢性经皮毒性试验结果应结合前期试验结果，并考虑到毒性效应指标和尸检及病理组 织学检查结果进行综合评价。毒性评价应包括受试物染毒剂量与是否出现毒性反应、毒性反 应的发生率及其程度之间的关系。这些反应包括行为或临床异常、肉眼可见的损伤、靶器官、 体重变化情况、死亡效应以及其它一般或特殊的毒性作用。成功的亚慢性试验应能够提出统 计学上有意义的无有害作用水平。 7.3 试验报告

试验报告应包括如下内容：

（1）受试物名称、理化性状、配制方法、染毒剂量、染毒面积、染毒方式等； （2 ）实验动物的种属、品系和来源（注明合格证号和动物级别）；

（3 ）饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、单笼饲养或群饲、实验动物房合格证号；

（4 ）试验方法；

（5 ）按性别和剂量的毒性反应数据；

（6 ）试验期间动物死亡时间或动物在实验结束时是否存活； （7 ）毒性作用或其它作用；

（8 ）观察到每个异常症状的时间及其转归情况； （9 ）食物摄入量和动物体重资料； （10）眼科检查结果； （11）血液学检查结果； （12）临床生化检查结果； （13）尸检所见；

（14）病理组织学检查所见的详细描述； （15）对结果进行处理的统计学方法； （16）结论。 8 试验结果的解释

亚慢性经皮毒性试验能够提供受试物在经皮反复接触时的毒性作用资料。其试验结果可 在很有限的程度上外推到人，但它可为确定人群暴露的无有害作用水平和允许暴露水平提供 有用的信息。

十六、致畸试验

Teratogenicity Test 1 范围

本规范规定了动物致畸试验的基本原则，要求和方法。 本规范用于检测化妆品原料的致畸性。 2 规范性引用文件

OECD Guidelines for Testing of Chemicals （No.414 ，January 2001 ） 食品安全性毒理学评价程序和方法（GB15193.14—2003 ）。 3 试验目的

检测妊娠动物接触化妆品原料后引起胎鼠畸形的可能性。 4 定义

致畸性：能在胚胎发育期引起胎鼠永久性结构和功能异常的化学物质特性。 5 试验基本原则

在胚胎发育的器官形成期给妊娠动物染毒，在胎鼠出生前将妊娠动物处死，取出胎鼠检 查其骨骼和内脏畸形。 6 试验方法 6.1 试剂

6.1.1 甲醛、冰乙酸、2 ，4 ，6-三硝基酚、氢氧化钾、甘油、水合氯醛、茜素红。 6.1.2 茜素红贮备液：茜素红饱和液，50%乙酸饱和液5.0mL，甘油10.0mL，1％水合氯醛 60.0mL 混合，放入棕色瓶中。

6.1.3 茜素红应用液：取贮备液3mL～5mL，用1g～2g/100mL 氢氧化钾液稀释至1000mL，

存于棕色瓶中。

6.1.4 茜素红溶液：茜素红0.1g，氢氧化钾10g，蒸馏水1000mL。 6.1.5 透明液A ：甘油200mL ，氢氧化钾10g，蒸馏水790mL 。 6.1.6 透明液B ：甘油与蒸馏水等量混合。 6.1.7 固定液（Bouins 液）：2,4,6-三硝基酚（苦味酸饱和液）75 份，甲醛20 份，冰醋酸5份。

6.2 实验动物和饲养环境

动物选择：首选为健康的性成熟大鼠。

实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。 6.3 剂量和分组

至少设三个剂量组，最高剂量应能引起母鼠某些毒性反应，但不应引起 10%以上动物 的死亡。最低剂量不会出现可观察到的毒性反应。另设阴性对照组。每组至少12 只孕鼠。 当初次进行致畸试验或使用新的动物种属和品系时，必须同时设阳性对照组，阳性对照物可 选用敌枯双、维生素A 等。 6.4 试验步骤

6.4.1 “孕鼠”的检出和给受试物时间

雌鼠和雄鼠按1：1 （或2 ：1）同笼，每日晨观察阴栓（或阴道涂片），查出阴栓（或精子）的当天定为孕期零天。如果5d 内没查出“受精鼠”，应调换雌鼠。检出的“受精鼠”按随机分组。在孕期6d～15d，每天经口给予受试物。孕鼠于孕期0、6、10、15 和20d 称重，并根据体重调整给受试物量。 6.4.2 孕鼠处死和一般检查

大鼠于妊娠第20d 处死。剖腹检查卵巢内黄体数，取出子宫，称重；检查活胎、早期吸收和死胎数。

6.4.3 活胎鼠检查

逐一记录胎鼠体重、体长、尾长、检查胎鼠外观有无异常，如头部有无脑膨出、露脑、 小头、小耳、小眼、无眼和睁眼、兔唇、下颌裂，躯干部有无腹壁裂、脐疝、脊柱弯曲，四 肢有无小肢、短肢、并趾、多趾、无趾等畸形，尾部有无短尾、卷尾、无尾、肛门有无闭锁。 6.4.4 胎鼠骨标本的制作与检查

将每窝 1/2 的活胎鼠放入95% （v/v ）乙醇中固定2 周～3 周，取出胎仔（或可去皮、去内脏及脂肪）流水冲洗数分钟后放入1g～2g/100mL 的氢氧化钾溶液内（至少5 倍于胎仔体积）8h～72h，透明后放入茜素红应用液中染色6h～48h ，并轻摇1～2 次/d ，至头骨染红为宜。再放入透明液A 中1d～2d ，放入透明液B 中2d～3d，待骨骼染红而软组织基本褪色，可将标本放在甘油中保存。也可将胎鼠剥皮、去内脏及脂肪后，放入茜素红溶液染色，当天摇动玻璃瓶2～3 次，待骨骼染成红色时为止。将胎鼠放入透明液A 中1～2 天，换到透明液B 中2～3 天。待胎鼠骨骼已染红，而软组织的紫红色基本褪色后，可将标本放在甘油中保存。（剥皮法）

将标本放入小平皿中，用透射光源，在体视显微镜下作整体观察，然后逐步检查骨骼。 测量囟门大小，矢状缝的宽度，头顶间骨及后头骨缺损情况，然后检查胸骨的数目，缺失或 融合（胸骨为6 个，骨化不全时首先缺第5 胸骨、次为缺第2 胸骨）。肋骨通常12～13 对， 常见畸形有融合肋、分叉肋、波状肋、短肋、多肋、缺肋、肋骨中断。脊柱发育和椎体数目 （颈椎7 个，胸椎12～13 个，腰椎5～6 个，底椎4 个，尾椎3～5 个），有无融合、纵裂等。最后检查四肢骨。 6.4.5 胎鼠内脏检查

每窝的 1/2 胎鼠放入 Bouins 液中，固定两周后作内脏检查。先用自来水冲去固定液，

将鼠仰放在石蜡板上，剪去四肢和尾，用刀片从头部到尾部逐段横切或纵切。按不同部位的 断面观察器官的大小、形状和相对位置。正常切面见图。

（1）经口从舌与两口角向枕部横切（切面1），观察大脑、间脑、延髓、舌及颚裂。 （2 ）在眼前面作垂直纵切（切面2 ），可见鼻部。 （3 ）从头部垂直通过眼球中央作纵切（切面3 ）。 （4 ）沿头部最大横位处穿过作横切（切面4 ）。

以上切面的目的可观察舌裂、颚裂、眼球畸形、脑和脑室异常。

（5 ）沿下颚水平通过颈部中部作横切，可观察气管、食管和延脑或脊髓。

以后自腹中线剪开胸、腹腔，依次检查心、肺、横膈膜、肝、胃、肠等脏器的大小、位 置，查毕将其摘除，再检查肾脏、输尿管、膀胱、子宫或睾丸位置及发育情况。然后将肾脏 切开，观察有无肾盂积水与扩大。 6.5 统计方法及结果评定

各种率的检查用Ｘ2 检验，孕鼠增重用方差分析或非参数统计，胎鼠身长、体重、窝平均活胎数用 T 检验。结果应能得出受试物是否有母体毒性和胚胎毒性、致畸性，最好能得出最小致畸剂量。

为比较不同有害物质的致畸强度，可计算致畸指数，以致畸指数10 以下为不致畸，10～ 100 为致畸，100 以上为强致畸。为表示有害物对人体危害的大小，可计算致畸危害指数， 如指数大于300 说明受试物对人危害小，100～300 为中等，小于100 为危害大。

7 试验报告

试验报告应包括下列内容：

（1）受试物名称、理化性状、配制方法、染毒剂量； （2 ）动物种属、品系、来源（注明合格证号和动物级别）、体重；

（3 ）实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物房合格证号； （4 ）剂量和组别：选择剂量的原则、剂量和组别、阴性和阳性对照物及剂量； （5 ）试验条件和方法；

（6 ）动物出现的毒性反应，发生时间及死亡情况；

（7 ）孕鼠体重增长和妊娠情况；

（8 ）结果：吸收胎和胎仔情况，有否内脏和骨骼畸形以及无作用剂量； （9 ）结论。 8 结果解释

解释致畸试验结果时，必须注意种属差异。试验结果从动物外推到人的有效性很有限。

十七、慢性毒性/致癌性结合试验

Combined Chronic Toxicity/Carcinogenicity Test 1 范围

本规范规定了动物慢性毒性/致癌性结合试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于化妆品原料的慢性毒性和致癌性的检测。 2 规范性引用文件

GB14924 实验动物与饲料标准

OECD Guidelines for Testing of Chemicals （No.453 ，Adopted ：12 May 1981） 3 定义

3.1 慢性毒性（chronic toxicity ）

动物在正常生命期的大部分时间内接触受试物所引起的不良反应。 3.2 最大无有害作用剂量（maximal no-adverse effect level ）

在一定时间内，受试物按一定方式与机体接触，用现代的检测方法或灵敏的观察指标， 未能观察到任何损害作用的最高剂量。

3.3 慢性有害作用阈剂量（chronic adverse effect threshed level ）

在一定时间内，受试物按一定方式与机体接触，用现代的检测方法或灵敏的观察指标， 能够使机体在某项敏感观察指标发生异常所需的最小剂量，即使机体出现毒性反应的最低剂 量。

3.4 化学致癌物（chemical carcinogen ）

能引起肿瘤，或使肿瘤发生率增加的化学物。 4 原理

化学物质在体内的蓄积作用，是发生慢性中毒的基础。慢性毒性试验是使动物长期地以 一定方式接触受试物引起的毒性反应的试验。

当某种化学物质经短期筛选试验证明具有潜在致癌性，或其化学结构与某种已知致癌剂 十分相近时，而此化学物质有一定实际应用价值时，就需用致癌性试验进一步验证。动物致 癌性试验为人体长期接触该物质是否引起肿瘤的可能性提供资料。 5 试验的基本原则

在实验动物的大部分生命期间将受试化学物质以一定方式染毒，观察动物的中毒表现， 并进行生化指标、血液学指标、病理组织学等检查，以阐明此化学物质的慢性毒性。

将受试化学物质以一定方式处理动物，在该动物的大部分或整个生命期间及死后检查肿 瘤出现的数量、类型、发生部位及发生时间，与对照动物相比以阐明此化学物质有无致癌性。 6 实验动物和饲养环境 6.1 种类和品系的选择

为选择合适的动物（种类和品系），应该进行有关的急性、亚急性和毒物动力学试验。 在评价致癌性时常用小鼠和大鼠，而进行慢性毒性试验常用大鼠和狗。

对慢性毒性/致癌性结合试验，一般均采用大鼠，但这并不排斥使用其他种类。所选用 的品系应是对该类受试物的致癌和毒性作用敏感的。

6.2 性别和实验开始时的年龄

两种性别都应该使用，最常使用刚断奶或已断奶的年幼动物来进行慢性毒性和致癌性的 长期生物学试验。

在啮齿类动物断奶和适应环境之后要尽快开始试验，最好在6 周龄之前。 6.3 实验组的动物数

应保证试验结果的可靠性并能进行统计学处理，实验组和对照组动物，应采用随机分配 的方法。

每组都应有足够的动物数用来进行详细的生物学和统计学分析。

每一个剂量组和相应的对照组至少应该有50 只雄性和50 只雌性的动物，不包括提前剖杀的动物数。如需观察肿瘤以外的病理变化可设附加剂量组，两种性别各20 只动物，其相应的对照组两种性别各10 只动物。 6.4 动物的管理、饲料和饮水

必须严格的控制环境条件和合理的动物管理措施。 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。 7 剂量组和给受试物的频率

为了评价致癌性试验，至少要设三个剂量组的实验组及一个相应的对照组。高剂量组可 以出现某些较轻的毒性反应，但不能明显缩短动物寿命。这些毒性反应可能表现在血清酶水 平的改变，或体重增加受到轻度抑制（低于10%）。

低剂量不能引起任何毒性反应，应不影响动物的正常生长、发育和寿命。一般不应低于 高剂量的10%。

中剂量应界于高剂量和低剂量之间，可根据化学物的毒代动力学性质来确定。

结合慢性毒性试验，应附加一个实验组和相应的对照组。最高剂量应能产生明显的毒性。 一般每天给予受试物。如果所给的化学物质是混在饮水中或饲料中，应保证连续给予。 给受试物的频率也可以按其毒代动力学变化进行调整。

应设相应的对照组，除不接触受试物外，其他条件应和实验组相同。 8 给受试物的途径

口服，皮肤接触，吸入是三种主要给受试物途径。选择何种途径要根据受试物的理化特 性和对人有代表性的接触方式。

给受试物的频率按所选择的给予途径和方式可以有所不同，如有可能，应按照受试物的 毒代动力学变化进行调整。 8.1 口服试验

如果受试物是通过胃肠道吸收的则最好选用口服途径。按试验期限（9 ）中指明的试验 期限，把受试物混入饲料中、溶于饮水中，或用管饲法连续给予动物。混入饲料中的受试物 的最高浓度不应超过5% 。每周7 天给予受试物，中断染毒可使动物得到恢复或毒性缓解， 从而影响结果及以后的评价。 8.2 皮肤试验

选择皮肤接触方式是用于模仿人接触有关物质的一个主要途径，并作为诱发皮肤病变的 试验模型。有关诱导皮肤肿瘤的特殊试验在本规范中不作介绍。

吸入方式不是化妆品主要接触途径，因此吸入试验本规范不作介绍。 9 试验期限

在附加组中 20 只实验动物/每性别和 10 只相应对照组动物/每性别至少应该维持到 12个月。这些动物的剖杀，应是用于评价和受试物有关的，但并非老年性改变所导致的病理变化。致癌性试验的期限必须包括受试物正常生命期的大部分时间。 确定试验期限的几条准则：

（1）一般情况下，试验结束时间对小鼠和仓鼠应在18 个月，大鼠在24 个月；然而对某些生命期较长的或自发肿瘤率低的动物品系，小鼠和仓鼠可在24 个月，大鼠可在30 个月。 （2 ）当最低剂量和对照组存活动物只有25% 时，也可以结束试验。对于有明显性别差异的试验，则其结束的时间对不同的性别应有所不同。在某种情况下因明显的毒性作用只造成高剂量组动物过早死亡，此时不应结束试验。 阴性试验应符合下列标准：

（1）因自溶，被同类吃掉，或因管理问题所造成的动物损失在任何一组都不能高于10%。 （2 ）小鼠和仓鼠在18 个月，大鼠在24 个月时，各组存活的动物不能少于50% 。 10 试验方法 10.1 观察

至少每天进行一次动物情况的检查。每天还应有数次有目的的观察，如剖检死亡动物或 存入冰箱，将有病或垂死的动物分开或处死。及时发现所有的毒性作用的开始及其变化，并 能减少因疾病、自溶或被同类所食造成的动物损失。

详细记录动物的症状包括神经系统和眼睛的改变，可疑肿瘤在内的所有毒性作用出现和 变化的时间，以及死亡情况。

在试验的前13 周内，每周称量体重一次，以后每4 周称量一次。在试验的前13 周内， 每周检查一次动物的食物摄取情况，以后如动物健康状况或体重无异常改变，则每3 个月检查一次。

10.2 血液学检查

血液学检查（血红蛋白含量，血球压积，红血球计数，白血球计数，血小板，或其他血 凝试验）应在3 个月，6 个月，以后每隔6 个月及实验结束时进行，各组每个性别要检查20 只大鼠。每次采集的血标本应来自相同的大鼠。最高剂量组和对照组大鼠应在同样的时间间隔内进行白血球分类计数，中等剂量组大鼠只是在必要时才做。

在试验期间，如果大体观察表明动物健康恶化，应对有关动物进行血球分类计数检查。 高剂量和对照组动物要进行血球分类计数。如两组间有很大差异时，应对较低剂量组的 动物进行血球分类计数。 10.3 尿分析

收集各组每性别10 只大鼠尿样进行分析，最好是在做血液检查的同时并取自同一大鼠。 应测下列指标，可单个进行，也可每组相同性别的尿标本混在一起测定。

分析指标：外观；每个动物的尿量和比重；蛋白，糖，酮体，潜血（半定量）；沉淀物 镜检（半定量）。 10.4 临床化学

每6 个月及实验结束时，收集各组每性别的 10 只大鼠的血液标本进行临床化学检查， 尽可能在各个时间间隔内采取相同的大鼠血标本。分离血浆，进行下列指标测定：

总蛋白浓度；白蛋白浓度；肝功能试验（如碱性磷酸酶，谷丙转氨酶，谷草转氨酶，γ 谷氨酰转肽酶，鸟氨酸脱羧酶）；糖代谢，如糖耐量；肾功能，如血尿素氮。 10.5 病理检查

肉眼和病理检查常常是慢性/致癌性结合试验的基础。 10.5.1 肉眼剖检

所有的动物包括那些在实验过程中死亡或因处于垂死状态而被处死的，应进行肉眼检 查。在所有动物被处死前，应收集血样品进行血球分类计数。保存所有肉眼可见的肿瘤或可 疑为肿瘤的。

所有的器官或组织都应保留以进行镜下检查。一般包括下列器官和组织：脑* （髓/脑桥，小脑皮质，大脑皮质），垂体，甲状腺（包括甲状旁腺），胸腺，肺（包括气管），心脏，唾液腺，

肝*，脾，肾*，肾上腺*，食管，胃，十二指肠，空肠，回肠，盲肠，结肠，直肠，

膀胱，淋巴结，胰腺，性腺*，生殖附属器官，乳腺，皮肤，肌肉，外周神经，脊髓（颈， 胸，腰），胸骨或股骨（包括关节）和眼。肺和膀胱用固定剂填充能更好地保存组织。 10.5.2 组织病理检查

所有肉眼可见的肿瘤和其他病变都应进行病理检查。此外还要注意下列方面： （1）对所有保存的器官和组织进行镜下检查，详细描述发现的所有病变。 ①包括实验过程中死亡或处死的动物。 ②所有最高剂量组和对照组动物。 （2 ）在较低剂量组，由受试物引起或可能由受试物引起异常的器官或组织也应进行检查。 *啮齿动物每组每性别10 只，非啮齿动物全部标有*号的器官包括甲状腺及甲状旁腺都应称 重。

11 数据处理和结果评价 11.1 肿瘤发生率

肿瘤的发生率是整个实验终了时患瘤动物总数在有效动物总数中所占的百分率。有效动物总数指最早出现肿瘤时的存活动物总数。

实验终了时患瘤动物总数 肿瘤发生率= ————————————×100 有效动物总数 11.2 诱癌试验阳性的判断标准

采用结合国世界卫生组织提出的四条判断诱癌试验阳性的标准： （1）肿瘤只发生在试验组动物中，对照组无肿瘤；

（2 ）试验组与对照组动物均发生肿瘤，但试验组中发生率高；

（3 ）试验组动物中多发性肿瘤明显，对照组中无多发性或只少数动物有多发性肿瘤； （4 ）试验组与对照组动物肿瘤的发生率无显著性差异，但试验组中肿瘤发生的时间较早。 上述四条中，试验组与对照组之间的数据经统计学处理后任何一条有显著性差异即可认为检品的诱癌试验阳性。

11.3 诱癌试验阴性结果的确立

假如动物实验的规模为两种种属、两种性别，至少3 个剂量水平，其中一个接近最大耐受剂量，每组动物数至少50 只，实验组肿瘤发生率与对照组无差异，才算阴性结果。 12 试验报告

试验报告应包括以下内容：

（1）受试物名称、理化性状、配制方法；

（2 ）实验动物的种属、品系、性别、体重、数量和来源（注明合格证号和动物级别）； （3 ）实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、单笼饲养或群饲、实验动物室合格证号；

（4 ）试验方法：染毒途径和试验期限，剂量分组； （5 ）食物摄入量和动物体重资料；

（6 ）按性别和剂量的毒性效应数据，动物异常症状出现及时间； （7 ）血液学检查，尿分析，临床化学等检查结果；

（8 ）按性别和剂量的大体尸检和组织病理学检查，说明肉眼可见和镜检病变的性质； （9 ）数据处理和结果评价，包括肿瘤发生率、致癌性试验阳性的判断标准，对结果进行处理的统计学方法； （10）结论。