生物技术综合实验报告（原生质体相关）

⽣物技术综合实验报告（第⼀部分）

实验⼀⼯作液的配制、培养基配制、器⽫洗涤及灭菌⼀、实验⽬的

掌握各种⼯作液配制⽅法；了解植物培养基的构成及配制⽅法；掌握⾼温⾼压灭菌的⽅法。⼆、原理

培养基是植物组织培养的基本条件，同时也是关键因素。

湿热条件(121℃的蒸汽，10分钟)能够有效地杀灭附着在玻璃器⽫、器具以及溶液和培养基中的微⽣物达到灭菌的⽬的。三、器具和试剂

灭菌锅，天平，电炉，微波炉，三⾓瓶，封⼝膜，移液管，移液器，量筒，烧杯，pH试纸，培养⽫，滤纸，Parafilm封⼝膜。琼脂，MS培养基⼤量元素，⽆菌⽔，葡萄糖，2, 4-D，IBA，KT （激动素），1M NaOH及HCl，卡那霉素，头孢霉素，⼄酰丁⾹酮。四、实验内容

PH调节剂的配制、培养基母液的配制、培养基的配制、各种相关物品的准备（⼀）培养基的配制步骤

1、取个⼲净烧杯，加⼊1/3-2/3左右的蒸馏⽔，⽤移液管取所需的母液加⼊烧杯。2、称取定量的蔗糖加⼊烧杯中并不断搅拌，直到完全溶解，定容。3、⽤NaOH或者稀HCL调剂酸碱值。

4、称取定量琼脂糖加⼊烧杯中，加热煮沸搅拌，待琼脂完全溶解，分装。5、⾼压灭菌（121℃,15min-20min)。6、冷却，取出，备⽤。（⼆）棉花⽆菌苗培养基的制备

1、取25 ml MS⼤量元素母液，称取葡萄糖15g、于1升的烧杯中，定容后调pH值为6.0，加⼊7.5g/l 琼脂煮沸。

2、然后将其分装到100毫升的三⾓瓶中，每瓶40毫升。3、⽤封⼝膜封⼝后在灭菌锅中灭菌15分钟。4、灭菌后臵于⽔平的⼯作台上冷却即可。要求：配制1L

（三）拟南芥⽆菌苗培养基的制备

1、拟南芥⽆菌苗培养基：1/2 MS⼤量元素+蔗糖10g/L，PH值6.0；加⼊7.5g琼脂⾼温⾼压灭菌。

2、0.1%琼脂糖：0.1g琼脂糖/100ml 蒸馏⽔；⽆菌苗培养基和0.1%琼脂糖均121°⾼压灭菌15分钟。

3、另准备20套9cm培养⽫，灭菌。

要求：配制0.5L，装1瓶灭菌，灭菌后培养基倒⽫。五、注意事项

1、为了尽量减少⼈为的误差，必须严格按实验步骤进⾏操作，严格按照要求的量来配制⼯作液、母液及培养基。

2、应当把培养基中的各种成分都写在纸上，加进去⼀个以后即划掉⼀个。3、所有装着培养基的试管、玻璃罐、玻璃瓶和培养⽫等都应当清楚地做上标记。4、每⼩组的操作的具体事项请参照⿊板上贴的任务分组。

5、爱护实验仪器及耗材，⼩⼼使⽤玻璃器⽫，合理灭菌，因为灭菌耗时较长。实验⼆⽆菌苗的制备⼀、原理

化学灭菌：0.1%升汞(Hgcl2)溶液浸泡10分钟可以对棉花种⼦等外植体进⾏灭菌，84消毒液（2%的次氯酸钠）浸泡3分钟可以对拟南芥等⼩种⼦外植体进⾏消毒。

物理消毒：紫外灯消毒、酒精灯⽕焰或⾼温烧灼5min左右可有效杀死镊⼦、剪⼑等不锈钢操作器具的菌类达到消毒的⽬的。⼆、实验材料、器具和试剂

棉花品种YZ1;拟南芥col-0野⽣型灭菌锅，天平，电炉，三⾓瓶，封⼝膜，镊⼦，酒精灯，剪⼑，移液管，超净⼯作台。0.1%升汞溶液，84消毒液，75%酒精三、实验内容

（⼀）拟南芥⽆菌苗培养基倒⽫

1. 取上次灭菌好的拟南芥培养基（500ml装），稍微拧松瓶盖，微波炉煮沸，边煮边摇动，⾄全部融化。2. 将上次灭菌好的9cm培养⽫分开放臵超净⼯作台（超净⼯作台需先打开）上。

3. 将融化好的培养基分装于培养⽫中（500ml/18-20⽫），将⽫⾄于超净台上吹⼲.。（⼆）共培养培养基的配制成分数量成分数量

MS⼤量元素(20倍）50 ml 2,4-D (0.1mg/ ml) 1 mlNH4NO3 (20倍) 50 ml ⽢氨酸(1000倍) 1 ml微量元素(100倍) 10 ml KT (0.1mg/ml) 1 ml铁盐(100倍) 10 ml 葡萄糖30g/L微⽣素(1000倍) 1 ml PH值 5.85-5.90肌醇(100倍) 1 ml

依次加⼊上述物质，调PH值5.85-5.90，然后分装⾄2个500ml蓝盖瓶，每瓶加⼊4g琼脂，灭菌，灭菌后倒⽫。（三）选择培养基的配制

共培养培养基+卡那霉素50mg/L + 头孢霉素400 mg/L灭菌后，待培养基凉⾄60度左右加⼊，混匀，倒⽫。（四）棉花⽆菌苗的制备

1、将棉籽⽤⼿术剪⼑去壳（每⼈3颗，饱满⽆病⾍害种⼦）。2、⽤0.1%的升汞灭菌13分钟。

3、⽆菌⽔冲洗三遍，接种于⽆菌苗培养基中。

4、28℃条件下暗培养7天（304培养箱）。（五）拟南芥⽆菌苗的制备

⼤量法灭菌：将拟南芥种⼦放⼊1.5ml离⼼管中，加⼊84消毒液：⽆菌⽔=1:1的混合液1ml，上下摇晃灭菌2min，弃消毒液；加⼊1ml 75%的酒精混匀1min，然后⽆菌⽔清洗4次；加⼊0.1%琼脂糖溶液悬浮种⼦，⽤移液枪涂布于拟南芥⽆菌苗培养基，吹⼲，封⼝。弱光培养两天⾄种⼦萌发，转⾄光照培养室培养两周（304培养箱）。五、注意事项所有操作（除数种⼦）均在超净⼯作台上进⾏。六、实验结果

⼀周后观察⽆菌苗的⽣长状况

1、六瓶接种的棉花⽆菌苗中有⼀瓶被轻度污染，其余五瓶⽣长状况良好。

2、拟南芥的⽆菌苗因涂布不均匀长势⼀般，幼苗较其他⼩组要弱⼩，叶⽚颜⾊较深。

实验三愈伤组织的诱导及农杆菌介导的棉花遗传转化⼀、实验⽬的

掌握植物体细胞胚胎发⽣的基本理论；了解植物愈伤组织在诱导和分化过程中的形态学、细胞学特征；进⼀步巩固植物离体培养和⽆菌操作的步骤；掌握植物遗传转化的⽅法、理论；掌握根癌农杆菌介导的植物遗传转化技术。

⼆、实验原理

植物细胞全能性：植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从⽽具备发育成完整植株的遗传能⼒。愈伤组织：

胚性愈伤：呈淡黄⾊或者黄绿⾊，质地较均匀；细胞球状或近球状，细胞核⼤，细胞质浓

⾮胚性愈伤：呈褐⾊、⽩⾊粉末状或⽩⾊、绿⾊坚硬块状；细胞⼀般为长柱状等⾮规则形状，细胞核⼩，细胞质较稀。农杆菌介导转基因的原理：植物细胞在受伤后，创伤分⼦诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达，导致T-DNA被剪切，加⼯，形成T-链蛋⽩复合体（T-复合体），通过农杆菌和植物细胞的细胞膜，细胞壁进⼊植胞内，T-复合体上的核靶向序列可引导T-DNA整合到植物基因组。三、材料与⽤品

1、实验材料：棉花材料YZ1（上周做的⽆菌苗）、农杆菌菌株LBA4404。

2、⽤具：超净⼯作台，显微镜，载玻⽚，天平，三⾓瓶，封⼝膜，橡⽪筋，镊⼦，酒精灯，培养⽫，滤纸，剪⼑，医⽤⼿术⼑，摇床。

3、药品：诱导、共培养培养基，卡宝品红染⾊液，MGL活化培养基，LB培养基，⼄酰丁⾹酮（AS）。四、实验步骤

（⼀）棉花愈伤组织的诱导及观察1、愈伤诱导培养基的配制（第1周已做）2、⽆菌苗的制备

3、⽆菌苗的切取：选取培养7天左右健壮的⽆菌苗臵于垫有滤纸的培养⽫上，⽤解剖⼑切掉⼦叶及⽣长点，切掉胚根及相连的约1/4的下胚轴，余下的下胚轴⽤作愈伤组织诱导的外植体，⽤解剖⼑将下胚轴切成～0.7cm⼩段。

4、外植体接种及离体培养：将切离好的外植体接种于愈伤诱导培养基上（每瓶约7段），平⾏放臵，28℃光照培养，每天14⼩时光照，进⾏愈伤组织诱导及增殖培养。

5、愈伤组织继代（⼀个⽉后）：待培养⼀个⽉左右，将增殖后的愈伤组织连同下胚轴切断继代到分化培养基上，进⾏胚性愈伤组织的分化。

6、愈伤组织形态观察：分别挑取少量⾮胚性愈伤和胚性愈伤组织，臵于载玻⽚上，滴⼏滴清⽔⽤镊⼦捣碎愈伤组织，然后滴加⼀滴卡宝品红染⾊数秒钟后，在显微镜下观察⽐较两者细胞学特征。（⼆）农杆菌介导的棉花下胚轴的遗传转化

1、共培养及选择培培养基的配制（第2周已做，没倒⽫的组倒⽫）2、⽆菌苗的制备（第2周已做）

3、农杆菌的活化（研究⽣帮忙做）：从超低温冰箱内取出保存菌株的⽢油管在冰上融化；按1:100的体积加⼊20ml LB液体培养基⾥摇菌，28℃暗培养36-48hr；将浑浊的农杆菌液涂布于LB平⽫上，28℃暗培养36-48hr；把培养基表⾯菌落刮⼊装有20ml MGL培养基的三⾓瓶中（按1/1000⽐例加⼊AS），28℃、200rpm摇30min；OD值在0.5-1.5之间（估计）即可⽤于侵染。

4、下胚轴与农杆菌共培养：把⽆菌苗切成~7mm茎段（同诱导程序），⽤镊⼦夹到经活化的菌液中进⾏侵染，摇匀，侵染10分钟；倒掉菌液，将下胚轴转⼊装有滤纸的灭菌培养⽫中，吹5分钟使表⾯稍为⼲燥；再将下胚轴分散布于垫有滤纸的共培养培养基中，19-21℃, 暗培养48-60⼩时结束共培养。

5、选择培养（48-60⼩时后）：把经过共培养的下胚轴⽤镊⼦转⼊选择培养基中，培养30天左右继代⼀次转⼊相同的选择培养基中。五、注意事项

1、在切⽆菌苗时，⼀定要使⽤锋利的⼑⽚,尽量做到⼀⼑能切断，避免挤压茎段。2、⽆菌苗培养时间不宜过长（培养七天最好）。

3、从超低温冰箱内取出的⽢油管，应尽量减少其在冰箱外的时间，⽤完后尽快放回冰箱。

4、侵染时下胚轴稍为⼲燥可以增加农杆菌的吸附。

5、共培养后第⼀次进⾏选择培养时应尽量使培养的环境保持⼲燥，可以减少农杆菌的污染。6、整个过程均为⽆菌操作环境。六、实验结果：

1．锥形瓶与平⽫中的下胚轴⽣长状况均良好，观察到平⽫中农杆菌介导转化的下胚轴有发⿊的现象，⽽锥形瓶中诱导的愈伤组织则⽆发⿊现象。

2．两个平⽫中的拟南芥均⽣长缓慢且幼叶发黄，推测原因可能与杂菌感染有关。

实验四植物原⽣质体的分离、纯化⼀、实验⽬的

了解植物原⽣质体分离和纯化的原理；掌握植物原⽣质体分离和纯化的⽅法；掌握原⽣质体活⼒测定和原⽣质体计数的⽅法。⼆、实验原理

植物原⽣质体是指细胞中去掉了细胞壁后的部分。

植物细胞在纤维素酶，半纤维素酶和果胶酶的作⽤下，细胞壁被消化。

纤维素酶的作⽤是降解构成细胞壁的纤维素，果胶酶是⽤来降解连接细胞的中胶层，使细胞丛组织中解离出来，可以得到裸露的原⽣质体。

原⽣质体在合适的培养条件下，能再⽣细胞壁，进⾏分裂、⽣长、形成愈伤组织，进⼀步分化成根和芽，长成新的植株，表现了植物细胞的全能性。三、材料与⽤品

1、材料：棉花胚性愈伤组织，拟南芥叶⽚。

2、器材和⽤具：低速离⼼机，⾎球计数板，不锈钢筛（140和400⽬），普通显微镜，玻璃试管及吸头。3、试剂：CPW9和CPW25溶液（⾼温⾼压灭菌），台盼蓝。四、实验步骤1、材料的准备

拟南芥⽆菌苗的制备（第2周已种）。2、原⽣质体酶解分离

（1）愈伤组织原⽣质体的分离：1g颗粒状、新鲜的愈伤组织于6cm培养⽫中，加⼊6 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封⼝膜封⼝，臵于摇床,40转酶解14⼩时。

（2）叶⾁原⽣质体的分离：取约2g拟南芥幼嫩叶⽚于6cm培养⽫中，⽤解剖⼑将叶⽚切碎，加⼊6 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封⼝膜封⼝，28℃⿊暗条件下酶解4⼩时。3、原⽣质体的纯化

（1）酶解后的原⽣质体-酶混合物经双层不锈钢⽹（140和400⽬）去掉残渣加⼊CPW9M 洗涤，滤液在10ml 的玻璃离⼼管中

离⼼4～5分钟（800rpm），使原⽣质体沉于管底，细胞壁等碎⽚浮在液⾯。（2）弃除上清夜，原⽣质体加⼊2ml的CPW9M轻轻混匀。

（3）在另⼀离⼼管中加⼊6ml CPW25S 溶液，在其上轻轻加⼊混有原⽣质体的CPW9M溶液，离⼼4～5分钟（800rpm），原⽣质体在两液⾯形成⼀条带，其它的杂质及少量的原⽣质体沉于管底。

（4）将原⽣质体轻轻地吸出，转⼊另⼀试管，加⼊5ml CPW9M溶液洗涤，离⼼4～5min（800rpm）。

（5）去掉上清夜,再⽤CPW9M 溶液洗涤，离⼼4～5min（800rpm），弃去上清液，加⼊1ml CPW9M溶液悬浮。4、原⽣质体活性检测

依红Y检测法：吸取少许原⽣质体悬液涂于载玻⽚上，滴⼀滴依红Y ，染⾊5分钟，轻轻加上盖玻⽚。在光学显微镜下观察，调整不同光源，取5任意视野分别总原⽣质体数和有活⼒的原⽣质体数。活⼒⽤暗视野下未染上⾊的原⽣质体数占同⼀明视野原⽣质体数的⽐例表⽰5、原⽣质体计数

（1）将⾎球计数板及盖⽚⽤⽔擦试⼲净；

（2）⽤滴管吸取少许原⽣质体悬液，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻⽚的下边缘摘⼊⼀⼩滴；（3）低倍镜下找到计数室后，再转换⾼倍镜观察并计数；

（4）求出每⼀个⼩格中原⽣质体平均数（N），按公式计算出每ml（g）悬液所含原⽣质体数量。五、注意事项

1、原⽣质体纯化时，两种洗液的使⽤顺序和⽤量的⽐例不要颠倒了。2、原⽣质体纯化时，吸取原⽣质体带动作要轻，尽量⼀次吸完。3、使⽤⾎球计数板时⾸先要清楚使⽤的是哪种计数板。

4、吸取悬液的量尽量少，避免悬液的⾼度过⾼，加盖⽚时要轻，以免原⽣质体密度不均⼀六、实验结果。5个视野内原⽣质体计数总数⽆活⼒原⽣质体有活⼒原⽣质体

数量（个）121 23 98