APC基因与家族性腺瘤性息肉病

APC基因与家族性腺瘤性息肉病

【关键词】 腺瘤性息肉病

【摘要】 家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis，FAP)是一种常染色体显性遗传病，该病的发生与结肠腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli，APC)突变密切相关. 大多数APC基因突变的结果是在其下游形成提前的终止密码，使APC蛋白呈“截短”改变，从而导致APC蛋白功能的障碍. 该基因容易发生自发的胚系突变，在结肠直肠腺瘤演变为癌的过程中起重要作用.

【关键词】 APC基因；突变；腺瘤性息肉病

1APC基因

1.1概述1986年APC基因首次由Herrera在一位患有直肠肿瘤及智力缺陷的Gardner综合征的患者染色体上发现，该患者的5号染色体长臂上有一段缺失. 随后发现APC基因是FAP的致病基因. APC基因是一个很大的管家基因（housekeeping gene），全长含有一个8538 bp的开放式可读框架，共15个外显子，6个可变地表达. 其中第15外显子独自含有6571个bp，组成77％的编码区，是人类已知最大的外显子，它共编码2843个氨基酸. 转录产物mRNA分子为8.9 kb，在很多细胞和组织中均有表达. Miyoshi等根据在多种肿瘤(包括结肠直肠肿瘤)中常见杂合子5q21的缺失，将APC基因归为肿瘤抑制基因. 在微细胞融合技术中，通过向结肠癌细胞系中转染含5q21区的正常第5号染色体，可逆转该肿瘤的恶性表现. 然而一旦去除转染的第5号染色体，

该细胞系又恢复了恶性行为，这表明5q21区确实存在着结肠癌的抑制基因. 另一方面，在FAP癌变患者中，5q21区高频发生的杂合性丢失（loss of heterozygosity， LOH）现象也支持了APC基因属于肿瘤抑制基因.

1.2基因突变APC基因突变类型主要有点突变和框架移码突变，前者包括无义突变，错位突变和拼接错误，后者包括缺失和插入. APC基因突变有300多种，这些突变遍及整个基因，60%以上的突变位于第15号外显子的5′端. 其中密码子第1286～1513号之间的10%左右的编码区集中了约65%的体细胞突变，被称为突变密集区(MCR). 大部分突变属于错位突变，由缺失或1~8个碱基对的插入引起. 大约95%的突变结果是在下游形成提前的终止密码子，使APC蛋白呈截短改变，这可能削弱了APC蛋白固有的抑制细胞增殖功能，从而导致APC蛋白功能的障碍；Jarvinena等［1］认为这些APC截短蛋白可以结合于野生型APC蛋白，并对野生型蛋白具有显性负效应， 使之失活而导致肿瘤发生. 目前国内外关于APC基因突变的研究很多，不同的报道所选择的研究目的基因也大都不相同，但大部分以研究15号外显子突变为主. Miyaki等［2］报道日本人在MCR以密码子1260~1453段突变率最高；国内王艳等［3］报道在1339~1436密码子区域突变率最高，1260~1359密码子区域突变率最低；而高枫等［4］将1337~1453段分为两段，分别设计引物扩增，也证实了上述说法.

1.3APC蛋白APC基因编码蛋白复合物可分成两个大区：羧基端区占75％，氨基端区占25％. 靠近氨基端的部分含有大量亮氨酸残基并具有与肌球蛋白、中间丝蛋白局部同源的序列；靠近羧基端的区域含有较多的丝氨酸残基、酸性氨基酸和脯氨酸残基. 这两个区域内存在螺旋螺旋（coiledcoils）结构，提示蛋白与蛋白之间的相互作用. APC蛋白的结合特性的研究提示，氨基端是同质寡聚反应的关键. 另外，起始的171个残基对复合物

形成起主要作用，在这171个残基中，前45个残基又是关键. 大多数APC基因突变产生的蛋白为171残基之外的剪切所致. 一般说来，截去末端的蛋白仍保留继续寡聚的潜力，还可构成灭活复合物，这就从本质上说明了突变蛋白的优势效应. APC蛋白的主要作用是与β连环蛋白（βcatenin）和E钙黏附蛋白相互作用而影响细胞黏附及细胞间信号传递，是β连环蛋白的负性调节子. β连环蛋白基因位于3q21，编码蛋白分子质量约92 ku. 蛋白结构包含有α连环蛋白、APC和Ｅ钙黏附蛋白的结合位点. 高水平的β连环蛋白可通过GSK3β使得APC蛋白磷酸化，从而促进其对β连环蛋白的降解效率，使胞质内β连环蛋白水平保持在一种平衡状态. 通过对APC基因突变的研究，人们发现，部分APC基因MCR的突变，可导致APC蛋白虽能与β连环蛋白结合，但却不能降解β连环蛋白［5］，提示在肿瘤发生中，APC基因突变的一个关键意义是失去对β连环蛋白的调节. 因为APC蛋白的β连环蛋白结合位点是高度保守的，证明突变型APC蛋白与β连环蛋白形成复合物的能力在肿瘤的发生中非常重要［6］. 此外，APC蛋白还结合微管，在细胞分裂和移动中起作用. APC可通过调控周期素依赖周期素激酶复合物的活性而调节细胞周期，它还通过诱导凋亡而介导其在结肠腺瘤发生中的作用，故被誉为结肠上皮完整性的分子性“门卫”（molecular \"gatekeeper\"）. APC基因的突变可改变APC蛋白与β连环蛋白及E钙黏附蛋白之间的平衡，导致细胞细胞、细胞基质之间黏附作用以及接触抑制信号传递的改变，引起细胞分裂与细胞死亡之间的平衡失调，以致生长失控，成为结直肠癌的一个限速的分子因素［7］.

2APC基因突变和FAP的发生

APC基因常见于家族性腺瘤性息肉病（FAP). 人类体细胞染色体为2倍体. FAP患者遗传一条突变APC基因，保留一条正常的等位基因. 不同于典型的孟德尔遗传疾病，只要

保留的正常APC等位基因发生突变，则出现多发性息肉. 有79% FAP患者保留的正常APC等位基因发生突变［8］. Nagase等发现约80%家族有APC基因突变. 对其中176例突变进行分析，发现98%以上的突变可导致APC蛋白截短，这些突变分别表现为为无义突变(33%)、小插入(6%)或缺失(55%). Miyoshi等［9］分别使用限制性片段长度多态性（RFLP）法及聚合酶链反应单链构象多态分析法（PCRSSCP），在检测FAP患者中APC基因突变与病理类型之间关系时发现，虽然FAP轻中度腺瘤存在着APC基因的胚系突变，但APC基因的LOH发生率却极低. 然而自重度腺瘤向黏膜内癌侵润发展的各病理类型中，LOH的发生率显著增加. 而且在侵润癌中，观察到了APC基因胚系突变与LOH同存的现象. 这些现象表明了APC突变基因的杂合子状态足以使FAP早中期腺瘤的形成，而APC基因突变加上杂合性丢失，则与向癌的进一步转化有关.

此外，突变定位与FAP的临床表现也有一定联系. 研究发现，APC基因最靠近5′端的突变（在外显子4或更近侧）产生轻型肿瘤表型，而靠近3′端MCR的突变产生重型表型［10］. 带状瘤与15号外显子的1445~1578密码子之间的突变有关，其近侧的突变先天性视网膜色素上皮增生（CHRPE）为阴性，而远侧的突变（在密码子463~1387之间）CHRPE为阳性；在密码子1403~1578之间的截短型突变与Gardner综合征有关;而另外一种缩减型息肉病（attenuated FAP，AFAP）患者的突变常位于APC基因第3，4号外显子的5′末端和密码子1578的3′端［11］. 基因型与表型之间的关联可以用正常APC分子间的二聚体作用来解释. 远侧的突变靠近3′端，产生一段较少截短的蛋白质，可与野生型APC蛋白质结合并干扰其功能（即显性负效应）；而靠近5′端的突变产生严重截短的蛋白质，不能二聚体化，使野生型蛋白质保持正常功能. 除该病表现的差异外，息肉数目也与突变位点有一定联系. 通常认为，息肉数目1000以下为稀疏型，数目在5000以上为密集型. 密码子1249附近的突变及密码子1465远端突变与稀疏型有关，而密码

子1250与1330之间的突变与密集型有关. 此外，密码子1309点突变与胃肠道症状较早出现有关.

虽然APC基因突变直接导致FAP发生，但其意义不只限于FAP病，在非FAP的散发性结直肠肿瘤中同样观察到了APC基因的突变［12］. 这表明APC基因突变不仅与FAP发生有关，而且涉及非FAP的散发性结直肠肿瘤. 并且，APC基因突变发生于小于1 cm腺瘤的事实，提示APC基因突变是结直肠肿瘤发生过程中的早期事件.

3APC基因突变检测方法

通过检测APC基因突变，可筛选出FAP家族成员高危患者，也可用于评估结直肠癌的疗效和预后，所以检测APC基因变化对预防、早期诊断及早期治疗结直肠癌具有重大意义［13］. 检测APC基因突变的方法报道较多，大致分为3类. 第1类，直接序列分析，PCRSSCP法. 检测APC基因高度多态性DNA标记，不必对整个庞大的APC基因所有外显子进行检测［14］. 应用微卫星多态性标记进行LOH分析是目前抑癌基因定位和等位基因丢失研究中最经常采用的方法. APC基因等位丢失亦常出现在散发性结直肠癌中，LOH发生率为35%～45%［15］. 此类方法适合于较小片段基因(100～500 bp)突变的检测，对APC基因需分成40个相互重叠的片段来检测，费时，费力. 第2类，包括异源脱氧核糖核酸分子(DNA)分析法(Hdxa)和错配化学清除/羟胺锇酸酐(CCM/HOT)等. 一次可检测较大片段的DNA，减少受检片段，如CCM/HOT法使之降到25个片段. 然而，仍要对外显子进行突变检测，需较大片段的序列分析来确定，对APC基因检测也非简便的方法. 第3类，是针对基因突变产生终止密码而表达不全蛋白质(截短蛋白质)来设计的. 如体外合成蛋白质试验(IVSP法)和蓝/白选择试验，可以检测大片段的DNA或RNA，又

能选择性发现产生终止密码的突变，与蓝/白选择试验不同的是，IVSP法还可根据不全蛋白大小来确定突变的位点. 通过对APC基因进行体外合成蛋白质及等位基因特异性表达的测定，可以更有效地检测到不能被PCRSSCP法所检测到的APC基因突变.

总之，由于APC基因突变与FAP早期发生密切相关，且FAP具有较高的遗传倾向，这种疾病如果不加治疗，其恶变率几乎达到100%，所以对APC基因的定位及其功能的研究对于FAP的早期诊断和治疗显得尤为迫切和重要［16］. 如果说最初APC基因的发现为FAP的分子诊断学提供了理论基础，则目前APC基因的研究进展正使针对这种疾病的分子诊断方法成为可能. 相信通过对APC基因的进一步研究，不仅会有更实用的基因检测诊断方法问世，而且可能得到针对肿瘤发生机制的特异性基因治疗方法.

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