西部医学２０１１年１２月第２３卷第１２期Ｍｅｄ Ｊ Ｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１１，Ｖｏ１．２３，Ｎｏ．１２ ・２３０３・ 大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和鉴定＊ 田诗政，杨志宏，冯国华，唐俊明，陆 华 （湖北医药学院附属人民医院烧伤整形科・临床医学研究所，湖北十堰４４２０００） 【摘要】 目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（ＢＭＳＣｓ）体外分离培养方法及其生物学特性。方法 采用全骨髓贴 壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞，取第３代骨髓间充质干细胞，通过成骨、成脂肪诱导分化以及流式细胞仪分析其 表面标记（ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９０）等鉴定ＢＭＳＣｓ特征。结果 全骨髓贴壁培养法获得的ＢＭＳＣｓ，原代和传代培养 具有活跃的增殖能力；ＢＭＳＣｓ经诱导后可分别向成骨、成脂转化；流式分析表面标志分子高表达ＣＤ９０（９６．５ ）、ＣＤ２９ （９２．３％），低表达ＣＤ３４（０．８９ ）、ＣＤ４５（１．４１％）。结论ＢＭＳＣＳ具有潜在的多向分化能力。 全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增ＢＭＳＣｓ，分离培养的 【关键词】骨髓问充质干细胞；培养；分化 【中图分类号】Ｒ－３３；Ｑ ８１３ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—３５１１．２０１１．１２．００３ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ。ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ＴＩＡＮ Ｓｈｉ－ｚｈｅｎｇ，ＹＡＮＧ Ｚｈｉ－ｈｏｎｇ，ＦＥＮＧ Ｇｕｏ－ｈｕａ，ｅｔ ａｌ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｕｒｎｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｒｅｎｍｉｎ Ｈｏｓｐｉｌａｌ， Ｈｕｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈｉｙａｎ ４４２０００，Ｈｕｂｅｉ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ＢＭＳＣｓ）ｏｆ ｒａｔｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ＢＭＳＣｓ ｏｆ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｃｕｌ— ｔｕｒｅ．ＢＭＳＣｓ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｕｌｔｉ—ｄ讧ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒ ａｓｓａｙ（ＣＤ２９，ＣＤ３４，ＣＤ４５，ＣＤ９Ｏ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＢＭＳｃＳ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅ ＢＭＳＣｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂ— ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｈａｄ ｇｏｏｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．ＢＭＳＣｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ ｌｉｐｏｂｌａｓｔｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ９５．５ ＢＭＳＣｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＣＤ９０，９２．３ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＣＤ２９，０．８９％ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＣＤ３４ ａｎｄ １．４１ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＣＤ４５．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＢＭＳＣｓ ｃａｎ ｂｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｙ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ＢＭＳＣｓ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍｕ１ｔｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ 骨髓间充质干细胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎ— 重（４０±５）ｇ。动物在屏障系统环境下，用专用饲料和 灭菌水分笼饲养。 １．１．２ 实验试剂ＤＭＥＭ培养基（美国Ｇｉｂｅｏｌ公 司）；胎牛血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ，杭州四季青 ｃｈｙｍａｌｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）是中胚层来源的具有多向 分化潜能的干细胞，获取方法简单，体外培养条件要 求不高，持续增殖能力强，体内移植无或具有弱排异 反应，易于被外源基因转染并稳定表达，在细胞工程、 组织工程中具有广泛应用前景，但是骨髓中只含有少 生物工程有限公司）；胰酶（（Ｔｒｙｐｓｉｎ，Ｓａｎｇｏｎ）； ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９０（美国ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｅｅ公司）；地 量ＢＭＳＣｓ，在骨髓的有核细胞中所占的比例约为１／ １０００００，难以满足组织工程和细胞治疗的需要，且易 塞米松、Ｂ一磷酸甘油、维生素Ｃ、胰岛素、４，６一联脒一２一苯 基吲哚（４，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２一ｐｈｅｎｙｌ—ｉｎｄｏｌｅｄｉ—ａｃｅｔａｔｅ，Ｄ Ａ 与其他细胞相混杂，探索理想的ＢＭＳＣｓ体外培养扩 增方法和鉴定方法具有重要的理论意义和现实意义。 １材料与方法 １．１材料 Ｐ Ｉ），茜素红（Ｓｉｇｍａ），油红Ｏ（Ｓｉｇｍａ）。 １．１．３主要仪器ＣＯ。细胞培养箱（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），超净 工作台（Ｎｕａｉｒ），低温高速离心机（Ｈｅｒａｅｕｓ），倒置相 差显微镜（Ｎｉｋｏｎ），图像分析系统（美国Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒ— 选取幼年ＳＰＦ级ＳＤ大鼠６只，体 ｎｅｔｉｃｓ公司）。 １．２方法 １．１．１实验动物基金项目ｌ湖北省教育厅重点项目（Ｄ２０１０２１０７） １．２．１ ＢＭＳＣｓ的培养采用全骨髓法：给予大鼠腹 ・２３０４・ 西部医学２０１１年１２月第２３卷第ｌ２期 Ｍｅｄ Ｊ Ｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１１，Ｖｏ１．２３，Ｎｏ．１２ 腔注射肝素５０００Ｕ，１５ｍｉｎ后断颈处死，７５％乙醇浸泡 长，增殖迅速。原代培养２４ｈ后首次换液，可见单个 ５ｍｉｎ，无菌条件下取出两侧股骨，切除两端干骺端，显 露骨髓腔，２ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ反复冲洗骨髓腔至骨 头发自，收集冲洗液，１５００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，弃上清 液，加入含有１５ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液，反复吹打均 匀。将细胞悬液按１×１Ｏ 细胞／ｍＬ接种于７５ｃｍ 培 养瓶，于３７℃、５ ＣＯ。细胞培养箱中培养２４ｈ后半量 核细胞贴壁，呈圆形，７２ ｈ细胞贴壁增多，可见短小梭 形或多角形。细胞呈梭形散在或集落生长。培养３～ ４ ｄ，细胞增殖速度加快并开始互相融合；培养６～７ｄ， 细胞可达９０ 融合，平行排列呈漩涡状或辐射状，细 胞形态以长梭形为主，可传代，见图１。传代ＢＭＳＣｓ 潜伏期较短，约１～２ｄ，对数生长约３～４ ｄ。一般传代 换液，去除未贴壁的细胞。以后每２天半量换液一次，６ ～细胞４～５ｄ可再次传代。 ２．２ ＢＭＳＣｓ的鉴定 ＢＭＳＣＳ成脂诱导分化４８ｈ后 ７ｄ后细胞密度达８Ｏ ～９０ ，用０．２５ 胰酶消化后 １：３传代，记为Ｐ１代ＭＳＣ（Ｐ１一ＢＭＳＣｓ），４０ｍｉｎ大部分细 胞贴壁后，全量换液，以后每４８ｈ全量换液。按上述方 可见少数细胞胞质内有折光性较强的脂粒出现，随着 培养时间延长，小脂粒逐渐聚集成较大的脂肪粒，脂 肪细胞数逐渐增多。油红Ｏ染色可见脂肪细胞胞质 中有大小不等的圆性橙红色脂肪滴，见图２。经成骨 诱导７ｄ后培养细胞集中，呈铺路石状，随着诱导时间 的延长，局部细胞呈重叠生长，逐渐堆积，矿盐沉积， 法传代培养。本实验所用细胞均为Ｐ３一ＢＭＳＣｓ。 １．２．２ ＢＭＳＣｓ的鉴定 ①成骨诱导：Ｐ３一ＢＭＳＣｓ培 养２４ｈ后，６孔板加入成骨诱导液（１５ ＦＢＳ－ＤＭＥＭ， 含地塞米松４×１０一ｍｇ／ｍｌ、１３－磷酸甘油ｌｍｇ／ｍｌ、维 生素Ｃ ０．５ｍｇ／ｍ１），对照组加入１５ ＦＢＳ—ＤＭＥＭ培 养液。每７２ｈ换液，诱导两周。茜素红染色鉴定矿化 结节。②成脂肪诱导：Ｐ３－ＢＭＳＣｓ培养２４小时后，１２ 孔板加入成脂肪诱导液（１５ ＦＢＳ－ＤＭＥＭ，含１０ｕｇ／ ｍｌ胰岛素），对照组加人１５ ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培养液，每 ７２ｈ换液。诱导两周。油红Ｏ染色鉴定脂肪细胞。 ③流式细胞术鉴定ＢＭＳＣｓ表面标记特征：Ｐ３一ＢＭ— 形成多个结节，并相互融合。茜素红染色结果显示细 胞问出现致密的、圆形不透光团块，呈现片状的淡红 色，着色区域范围广，面积大，见图３。流式细胞仪分 析表明，ＭＳＣ低表达ＣＤ３４（Ｏ．８９％）、ＣＤ４５（１．４１％）， 高表达ＣＤ９０（９６．５ ）、ＣＤ２９（９２．３ ），见图４。 ３讨论 ＢＭＳＣｓ具有来源易得、取材简单、增殖能力强以 ＳＣｓ培养至９０ ９，６融合时，０．２５ 胰酶消化后用２ ＦＢＳ的ＰＢＳ洗２～３次后再以２ ＦＢＳ的ＰＢＳ重悬细 及异体移植时排斥反应小等优点ｒ１ ］，由于经其分化 而来的组织细胞在进行自体移植时不存在组织配型 胞制成单细胞悬液。分别加人ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４５和 ＣＤ９０单克隆抗体，４＂Ｃ避光孵育１ｈ，再加入ＦＩＴＣ标 记的二抗，４℃避光孵育１ｈ。２ ９／６ＦＢＳ的ＰＢＳ洗涤２～ 和免疫排斥的问题，因此被认为是组织工程、细胞替 代治疗中所需细胞的最佳选择。但骨髓中ＢＭＳＣｓ的 含量极低，约占骨髓有核细胞的０．００１ ９／６～０．０１％［３］， 且其含量随年龄增长而逐渐减少［４］。因此，快速扩增 纯化和鉴定ＢＭＳＣｓ方法的建立对于干细胞移植治疗 具有重要意义。 从骨髓分离获得ＢＭＳＣｓ的方法主要有贴壁培养 法、密度梯度离心法、流式细胞术和免疫磁珠分离法。 ３次，用２％ＦＢＳ的ＰＢＳ重悬ＭＳＣｓ，上流式细胞仪 （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ公司产品）检测表面标志，应用 Ｃｏｔｆｉｔ软件分析结果。 ２ 结果 ２．１ ＢＭＳＣｓ的培养扩增 由于造血干细胞不贴壁生 长，经过数次换液，悬浮的造血干细胞逐渐被清除，贴 壁ＢＭＳＣｓ呈匀一梭形成纤维细胞样形态。呈集落生 采用贴壁培养法筛选出的ＢＭＳＣｓ活性高，而且骨髓 中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，促进 图１ Ｐ３代ＭＳＣｓ培养第５夭（×１００） Ｆｉｇｕｒｅ １ ＭＳＣｓ ｏｆ Ｐ３ ａｔ ５ ｄａｙ（×ｌＯＯ） 图２ ＭＳＣｓ成脂转化（×ｌｏｏ） Ｆｉｇｕｒｅ ２ Ｌｉｐｏｉｄ—ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＳＣｓ（×１００） 图３ ＭＳＣｓ成骨转化（Ｘ１００） Ｆｉｇｕｒｅ ３ Ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＳＣｓ（Ｘ １００） 西部医学２０１１年１２月第２３卷第１２期 Ｍｅｄ Ｊ Ｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ，Ｄｅｃｅｍｂｅ！ ！ ！ ！ ： ｌ ０．４５％ ２ ｌ １．３１％ ２ ｌ ９２．３％ ２ １０００ ‘‘：： ｌ１． ．．’． ． ： ‘ ：：＿ ● ’‘。 － ｌ￡ ．．． ． ｝‘ Ｆ ．． ． ． ～ ・： ．’ ：驾 ： ； ：麓一ｊ ： ’ ：榔ｊ ’ 。 ４ ｝ ３ ４ － Ｉ ｌ０００ ０ ＿●ｌ １．４１％ ２ ｌ０００ ｌ ０．８９％ ２ ，● ０ 凸 ０ ≮鼙 ： ’ Ｉｔ ● ＾ ● ＿ ｆ ： Ｅ Ｃ ｜ ． ４ ’ ． ，３ ４ ，‘ ’ ．・ ： ●ｔ ● 域 ０ ４ ｔＣＤ３一ＰＥ—ＣＹ５ ＣＤ３．ＰＥ．ＣＹ５ ＣＤ３一ＰＥ—ＣＹ５ 图４流式细胞术鉴定Ｐ３－ＢＭＳＣｓ的表面标志结果：ＣＤ２９、ＣＤ９０强阳性表达，ＣＤ３４、ＣＤ４５阴性表达 Ｆｉｇｕｒｅ ４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ｐ３－ＢＭＳＣｓ ＢＭＳＣｓ贴壁生长［５］。遵循科学操作流程和适当处理 的基础上，采用全骨髓贴壁筛选法分离培养ＢＭＳＣｓ 是一种快速可靠、简便稳定的技术方法，在实际应用 中优于密度梯度离心法。在本实验的体外培养条件 化标志的成骨细胞也能在地塞米松和吲哚美辛的诱 导下向脂肪细胞分化［６］。文献报道［７］，地塞米松、维生 素Ｃ和甘油磷酸钠是ＢＭＳＣｓ向成骨细胞分化和体外 成骨的必要条件。地塞米松可促进成骨细胞分化成 下，传代后细胞生长速度明显增快，原代培养需要６～ 熟，促进细胞外基质胶原合成。维生素Ｃ能促进培养 细胞合成胶原，形成钙化，非胶原基质蛋白的合成。 甘油磷酸钠能为成骨细胞提供磷酸离子，促进生理性 钙盐的沉积和钙化，是ＢＭＳＣｓ发生矿化结节的必要 条件。因此本实验根据文献报道采用地塞米松、维生 素Ｃ和Ｂ一甘油磷酸钠联合诱导，观察到ＭＳＣｓ在体外 培养时能够向成骨细胞形态转化，形成矿化结节。 ７ｄ，而传代后细胞融合仅需４～５ｄ即达到９０ ，可再 次传代。 本实验结果显示，提高接种密度可以缩短原代培 养时间。其原因可能有：增加ＢＭＳＣｓ数量；接种后 ２４ｈ半量换液，可除去未贴壁的非ＢＭＳＣｓ细胞，此时 培养液中的养分不会被过多消耗，在逐次更换培养液 过程中可被除去。又利用ＢＭＳＣｓ的贴壁特性，经过 多次换液后即可去除造血细胞、红细胞等悬浮细胞， 从而获得均一性较好的ＢＭＳＣｓ。实验中可以观察到 本实验中发现在成骨诱导培养基中培养１４天后 大部分细胞有矿化结节出现，且其成骨分化能力较 强。而在含胰岛素的培养基中培养ｌ４天后，大部分细 胞油红Ｏ染色阳性，说明成脂诱导培养基亦可定向诱 接种后的ＢＭＳＣｓ贴壁非常迅速，具有很强的环境适 应能力及较高的接种成活率，说明ＢＭＳＣｓ在体外培 养条件下具有很强的增殖能力，可迅速大量地获得细 胞。 导ＳＤ大鼠的ＢＭＳＣｓ分化为脂肪细胞。 目前尚未找到特异性分子标记来鉴定和识别 ＢＭＳＣｓ，一般认为，ＣＤ４４、ＣＤ９Ｏ、ＣＤ２９等是ＢＭＳＣｓ 的重要表面标志物，不表达造血细胞的标志ＣＤ３４、 ＣＤ４５或ＣＤ１４［８ ］。目前主要是通过免疫方法及其形 态和培养特性结合进行ＢＭＳＣｓ鉴定。本研究选用 ＢＭＳＣｓ是存在于骨髓中的间充质多能干细胞，在 不同的诱导条件下可分别向成骨细胞、脂肪细胞、软 骨细胞等方向分化，而且即使已表现骨钙素等成熟分 ・２３０６・ 西部医学２０１１年１２月第２３卷第１２期 Ｍｅｄ Ｊ Ｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１Ｉ，Ｖｏ１．２３，Ｎｏ．１２ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｂｏｎｅ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｈｅｒｏｐｙ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９４，５６（３）：２８３． Ｈ，Ｃａｐｌａｎ ＡＩ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｃｃｒａｍｉｃｓ：ｆｒｏｍ ［４］ ＯｈｇｕｓｈｉＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ２９对ＢＭＳｃｓ进行鉴定，结合 细胞形态学观察证明分离培养的细胞为ＢＭＳＣｓ。 ４结论 本研究结果显示，在Ｐ３代培养细胞中，造血干细 胞标志性抗原ＣＤ４５极低（１．４１ Ａ），而ＢＭＳＣｓ标志 ｏＣＤ９０（９６．５ ９／６）高表达，提示反复贴壁筛选法代培养获 取的细胞非造血干细胞，是纯度高的ＢＭＳＣｓ。本实验 ｃｅｌｌ ｔｏ ｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ，】９９９，４８（６）： ９１３－９２７． ［５］ Ｖａｑｕｅｒｏ Ｊ，Ｚｕｒｉｔａ Ｍ．Ｏｙａ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ｂｏｎｅ ｍａｒ— ｒｏｗｓ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｒａｐｌｅｇｉｃ ｒａｔｓ：ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｏｒ ｌｏｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，２００６，３９８（１）：１２９～１３４． ｓｇａａｒｄ Ｍ Ｋ。Ｃ１ ｅｍｍｅ ｓｅｎ ０，ｅｔａ１．Ｇｕｓｔａｆｓ ｓｏｎ Ｆ． ［６］ Ｓｃｈｏｕ Ｍ，Ｄａ １Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ ＰＲ，Ｓｅｅｈｅｒ ＮＨ．Ｋｉｄｎｅｙｓ ｅｘｔ ｒａｃｔ ＢＮＰ ａｎｄ ＮＴ—ｐｒｏＢ— 试图通过诱导分化后油红Ｏ染色和茜素红染色反向 证明所培养的细胞为ＢＭＳＣｓ，结果显示，培养细胞经 ＮＰ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｙｏｕｎｇ ｍｅｎ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００５．９９（５）：１６７６— １６８０． 诱导后可分化为成骨细胞和成脂细胞，进一步表明该 细胞群为具有多向分化潜能的干细胞，而不是骨髓内 的其他成熟细胞。但本实验结果仍不能说明其纯化 ＴＬ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉ— ［７］ Ｃｈｅｎ ｔｏｔｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ｅｕｈｕｒｅｓ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｄｏ— 程度，因此有关干细胞表型标志物的探索和寻求仍是 干细胞组织工程的一个艰巨任务。 【参考文献】 ｔｔｅｎｇｅｒ ＭＦ，Ｍａｒｔｉｎ ＢＪ．Ｍｅｓｅｎｅｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｏ— ［１３ Ｐｉｎｏｒ ａｇｅ ａｎｄ ｇｌｕｅｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｂｏｎｅ，２００４，３５（１）：８３— ９５． ｅ ＤＡ，ＡＩｆｏｎｓｏ Ｚ，Ｚｕｋ ＰＡ．ｅｔ ａ１．Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ［８］ Ｄｅ Ｕｇａｒｔｓｔｅｍ ｃｅｌｌｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｎ ｍｕｌｔｉ—ｌｉｎｅａｇｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗＥＪ］．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ，２００３，８９ （２３）：２６７—２７０． ｔｅｎｔｉａｌ ａｓ ｃａｒｄｉａｃ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ［Ｊ］Ｃｉｒｅ Ｒｅｓ，２００４，９５（１）：９－２０． ｙａ Ｉ，Ｌａｒｓｏｎ ＢＬ，Ｖｕｏｒｉｓｔｏ ＪＴ，ｅｔ ａ１．Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ［ｚ２ Ｓｅｋｉｏｆ ｈｕｍａｎ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａ（ＢＭ—ＭＳＣｓ） ａｖｉｎ ＮＷ。Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ｊ。Ｓｃｈｏｎｍｅｙｒ ＢＨ，ｅｔ ａ１．Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｄｏ＋ ［９］ Ｃｌｓｅｓ ｏｆ ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｆｅｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｔｏ ｍｅｓｅｎｃｈｙａｍｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ．Ｐｌａｓｔ Ｒｅｃｏｎｓｔｒ Ｓｕｒｇ［Ｊ］．２００８，１２２（３）：７３９—７４８． （收稿日期：２０１１－０６—０７；编辑：母存培） ［Ｊ］．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ，２００４，１９（２）：２５６—２６４． ＳＰ，Ｆｉｎｋ ＤＪ，Ｃａｐｌａｎ ＡＬ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｏｎｅ ［３］ Ｂｒｕｄｅｒ（上接第２３０２页） ［６］ ＭｉｎＫｙｕｎ Ｎａ，ＪｕｎＰｉｌ Ｊａｎｇ，Ｂｙｕｎｇ Ｓｕｎ Ｍｉｎ，ｅｔ ａ１．Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｃｙｌｐｈｌｏｒｏｇ１ｕｃｉｎｏｌｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ 整个分离过程对实验室条件的要求：室温不高于 ２５℃，环境干燥而避光，缓冲层析柱体须进行遮光，并 用紫外灯监视各成分带的分离行为。 ４结论与建议 ［７］Ｄｒｙｏｐｔｅｒｉｓ ｃｒａｓｓｉｒｈｉｚｏｍａ［Ｊ］．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ，２００６， １６：４７３８－４７４２． Ｌｏｕｎａｓｍａａ Ｍ，Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ Ａ，Ｗｉｄｅｎ ＣＪ，ｅｔ ａ１．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｓｏｍｅ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｐｈｌｏｒ０ｇｌｕｃｉｎｏ１ Ｄｅｒｉｖａ— ｔｉｖｅｓ．Ｐａｒｔ．Ｔｈｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｏｍｅ Ｍｏｎｏ－ａｎｄ ＳＢｉｃｙｃｌｉｃ Ｐｈｌｏｒｏ～ 优化后的缓冲硅胶层析柱法具有分离效果好、速 度快、样品损失率小、稳定性和重复性好等优点，适用 于间苯三酚类化合物的分离和纯化，将有助于推进绵 马贯众问苯三酚类化学成分的系统研究。但本分离 ｇｌｕｅｉｎｏｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｒｏｍ Ｒｈｉｚｏｍｅｓ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｄｒｙｏｐｔｅｒｉｓ Ｓｐｅ— ｃｉｅｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ，１９７２，２６（１）：８９． ［８３ 高增平．绵马贯众有效成分的研究［Ｄ］．北京：北京中医药大学， ２００３：６９－８４． 方法仍有许多尚待改进的地方，建议广大药物研究工 作者对其三个主要的因素进行正交实验，探索出更优 的分离方法。 【参考文献】 ［１］ 尚志均．神农本草经校点［Ｍ］．芜湖：皖南医学院科研处，１９８１： １４０． ［９３ Ｗｉｄｅｎ ｃｊ，Ｐｙｙｓａｌｏ Ｈ，Ｓａｌｏｖａａｒａ Ｐ．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃ— ｃｕｒｒｉｎｇ Ａｃｙ１ｐｈｌｏｒｏｇｌｕｃｉｎｏｌｓ ｂｙ Ｈｉｇｈ—Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏ— ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９８０，１８８：２１３． ［１０］Ｗｉｄｅｎ ＣＪ，Ｈｕｈｔｉｋａｎｇａｓ Ａ．Ｐｈｌｏｒｏｇｌｕｃｉｎｏｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｒｙｏｐｔｅｒｉｓ ｐａｒａｌｌｅｌｏｇｒａｍｍａ ａｎｄ Ｄ．ｐａｔｕｌａ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９７３，１２：９３１． ［１１］肖国君．绵马贯众素的ＮＭＲ研究［Ｊ］．波谱学杂志．２００４，２１（２）： 恂，丁绪亮，等．现代中药学大辞典（上册）［Ｍ］．北 ２３１－２３４． ［２］ 宋立人，洪京：人民卫生出版社，２００１：１９３２—１９３５． ［１２］任强．中药抗急性淋巴细胞白血病活性成分的研究［Ｄ］．北京： ［３］ 李时珍．本草纲目［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，１９８２：７４５． ［４］ 吴寿金．杨秀贤．绵马贯众化学成分的研究（Ｉｆ）绵马贯众中间苯 三酚衍生物的质谱一质谱分析口］．中草药，１９９７，２８（１２）：７１２． 北京协和医学院，２００９：６５． ［１３］ 高增平，李世文，陆蕴如．等．中药绵马贯众的化学成分研究［Ｊ］． 中药学杂志，２００３，３８（４）：２６０—２６２． （收稿日期；２０１１—０９—１９；编辑：母存培） ［５］ 吴寿金，杨秀贤，张丽，等．绵马贯众化学成分的研究（Ｉ）［Ｊ］． 中草药．１９９６，２７（８）：４５８—４５９．