冬小麦成熟胚愈伤组织诱导及分化

2023-10-25 来源：钮旅网

第10卷第5期2004年10月

上海大学学报(自然科学版)

JOURNALOFSHANGHAIUNIVERSITY(NATURALSCIENCE)

Vol.10No.5Oct.2004

　　文章编号:100722861(2004)0520503205

冬小麦成熟胚愈伤组织诱导及分化

曹　原,　刘志学,　黄晔俊(上海大学生命科学学院,上海200436)

摘要:以4个冬小麦品种的成熟胚为外植体进行离体培养,研究了品种、不同激素组合以及不同预处理等因素对愈伤组织形成及分化的影响.结果表明,代表不同基因型的品种是影响离体培养的重要因素,成熟胚愈伤组织的诱导使用4mg/L的2,42D浓度较为有利,在MS+KT1mg/L+62BA2mg/L培养基上分化率较高.低温及CaCl2预处理对成熟胚愈伤组织的影响与小麦品种有关.关键词:冬小麦;成熟胚;愈伤组织;分化中图分类号:Q945　　　文献标识码:A

InductionandDifferentiationoftheCallusfrom

MatureEmbryosofWinterWheat

CAOYuan,　LIUZhi2xue,　HUANGYe2jun

(SchoolofLifeSciences,ShanghaiUniversity,Shanghai200436,China)

Abstract:Matureembryosoffourkindsofwinterwheatbreedswereusedasexplantstoculturein

vitro.Effectofgenotypeandotherfactorssuchaspretreatmentandhormonesoncallusformationand

differentiationofmatureembryoswasinvestigated.Theresultsshowthatgenotypeisthemostimportantfactoraffectingthecallusgeneration.ItispropitiousinformationanddifferentiationofcallusfrommatureembryosofwheattobeculturedintheMSmediumwith4mg/L2,42D.TheratioofdifferentiationishigherwhenculturedinamediumofMS+KT1mg/L+62BA2mg/L,andtheeffectsofpretreatmentoflowtemperatureorCaCl2arerelatedtowheatbreed.Keywords:winterwheat;matureembryo;callus;differentiation

　　体细胞胚发生是小麦组织培养植株再生的主要途径之一[1],又是决定植物遗传转化成败和效率的重要前提.不同基因型[2]、不同外植体[3]、不同培养基[4]和培养条件[5]诱导体细胞胚的难易程度存在很大差异.目前报道中常用的小麦外植体有幼胚、幼穗、幼叶、子叶中层、种子、顶端分生组织、成熟胚等,但最好的外植体源是幼胚和幼穗,其组织培养的愈伤组织诱导和植株再生能力最高[3].但幼穗、幼胚的采用受季节的很大限制,且其生理期的一致性也

较难得到保障,而种子保存期长、易获得,可用于较

长时间的研究.但成熟胚脱分化能力较弱,愈伤组织再分化能力差,如果能改变种子的生理状态,提高其胚性愈伤组织的形成能力,无疑将大大促进小麦胚性细胞系的建立.基于冬小麦抗条锈病、抗蚜虫转基因研究的需要,本实验以4个品种的冬小麦为材料,对其成熟胚的组织培养进行了研究,旨在获得良好的、分化率高的胚性愈伤组织.

收稿日期:2003210210　作者简介:曹　原(1978～),女,河北石家庄人,硕士生,主要从事植物分子生物学方面的研究.

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　　　　上海大学学报(自然科学版)第10卷　

1　材料和方法

1.1　植物材料

供试材料为甘肃省天水地区现行推广使用的冬

小麦品种89227、中88375、91921824和咸农四号,由甘肃省天水市农业局提供.1.2　培养基

愈伤组织诱导培养基:MS+2,42D(质量浓度分别为1、2、4、6、8、10mg/L)+LH500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L;愈伤组织分化培养基:以MS为基本培养基添加不同激素(见表2).1.3　试验方法1.3.1　取材与接种

图1　不同参试品种中2,42D浓度对成熟胚出愈率的影响

(每个品种处理的重复次数为5次)

Fig.1　Effectof2,42Dconcentrationtoformationofcallus

frommatureembryoofwheats

2.2　预处理对小麦愈伤组织形成及分化的影响

取收获后存放半年的种子,用清水冲洗干净并进行不同的预处理,接种前进行常规消毒:75%酒精处理1min,0.1%HgCl2处理15min,然后用无菌水冲洗4～6遍,接种于诱导培养基上,每瓶接种15枚左右.1.3.2　预处理方法

(1)对照:26℃条件下浸泡种子,浸泡时间为16h;(2)低温处理:4℃冰箱内浸泡种子,浸泡时间为20h;(3)CaCl2处理:250g/LCaCl2溶液浸泡种

),浸泡时间为20h.子(26℃

1.3.3　愈伤组织诱导、继代及分化的培养及统计

预处理对小麦愈伤组织形成及分化的结果见图

3.低温预处理使小麦91921824成熟胚出愈率明显提高,经t检验差异显著(出愈率t=2.5092,临界值t0.05=2.31),而对中88375成熟胚愈伤组织的诱导不存在显著的效应;该处理均引起两个小麦成

(e)),经t熟胚愈伤组织分化能力的提高(图2(d)、

检验存在显著差异(中88375愈伤分化率t=3.7992,91921824愈伤分化率t=3.04,临界值t0.05=2.45).

CaCl2预处理对两个小麦品种愈伤组织的形成

接种后将材料置于26℃暗培养诱导愈伤组织,记录愈伤组织开始形成的时间,并于培养20d后计算愈伤组织形成的频率;挑选良好的愈伤组织接种于继代培养基上,在相同的培养条件下进行继代培养,每20d继代一次;将继代2次的愈伤组织转入分化培养基上,在26℃光照培养20d后计算分化频率.采用t检验对数据进行统计分析.

均没有引起显著的效应,但却明显的促进了两个小

(f)),经t检验麦成熟胚愈伤组织的分化(图2(d)、

也存在显著差异(中88375愈伤分化率t=7.57,91921824愈伤分化率t=6.97,临界值t0.05=2.45).

2.3　小麦不同品种愈伤组织诱导率比较

2　结　果

2.1　不同2,42D浓度对小麦愈伤组织形成的影响

小麦品种对成熟胚愈伤组织诱导率影响较大.将4个品种小麦的成熟胚接种于愈伤组织诱导培养基,接种2d愈伤组织开始形成,一般培养5d后,愈伤组织便明显可见.愈伤组织诱导的同时常伴有芽的形成,芽的形成是种子活力旺盛的标志,同时也反映了种子的顽固性和保守性,在2,42D浓度小于2mg/L时形成大量芽体(图2(a)),并且芽体形成比愈伤形成要早.2,42D质量浓度为4mg/L时的出愈情况见表1,从表中可以看出不同品种间愈伤诱导率存在明显差异,其中小麦89227和咸农四号的出愈率较高,不存在显著差异,小麦89227诱导率显著高于中88375与91921824(中88375出愈率t=5.917,91921824出愈率t=5.32,临界t0.05=2.31),

在不同2,42D浓度下不同参试材料愈伤组织诱导的结果见图1.从图中可以看出:不同冬小麦品种对于2,42D的需求和耐受程度相差较大.小麦成熟胚的出愈率先随2,42D质量浓度的升高而增大,并在8mg/L时(咸农四号在4mg/L时)达到最大值,但当2,42D浓度大于该值时,出愈率反而随2,42D

(b)、浓度的增加而降低(部分出愈情况见图2(a)、

(c)).

　第5期曹　原,等:冬小麦成熟胚愈伤组织诱导及分化　　　　505

图2　图版说明　(a)在2,42D1mg/L培养基上诱导成熟胚愈伤组织,(b)在2,42D4mg/L培养基上诱导成熟胚愈伤组织,(c)在2,42

D10mg/L培养基上诱导成熟胚愈伤组织,(d)未经预处理诱导成熟胚愈伤组织分化,(e)低温处理诱导成熟胚愈伤组织分化,(f)CaCl2

处理诱导成熟胚愈伤组织分化

Fig.2　Plateexplain　(a)Formationofcallusfrommatureembryoofwheatculturedinmediumwith1mg/L2,42D.(b)Formationofcal2

lusfrommatureembryoofwheatculturedinmediumwith4mg/L2,42D.(c)Formationofcallusfrommatureembryoofwheatculturedinmediumwith10mg/L2,42D.(d)Differentiationofcallusfrommatureembryoofwheat.(e)Differentiationofcallusfrommatureembryoofwheatbypretreatmentoflowtemperature.(f)DifferentiationofcallusfrommatureembryoofwheatbypretreatmentofCaCl2

咸农四号诱导率显著高于中88375与91921824(中88375出愈率t=8.18,91921824出愈率t=7.19,临界t0.05=2.31).培养40d后将全部愈伤组织转到分化培养基⑤上进行分化培养(结果见表1),仅有少数愈伤组织分化出绿苗,同时形成根状物,其中91921824和咸农四号的愈伤组织质量较好,在分化

表1　小麦品种成熟胚愈伤组织诱导及分化情况

Tab.1　Resultofformationanddifferentiationofcallusfrom

matureembryosofwheats

愈伤组织诱导

小麦品种

接种数

89227

75806286

愈伤组织分化接种数分化率/%

72856479

6.88±2.48.07±3.918.73±4.516.32±3.9

出愈率/%

77.20±4.559.86±4.851.28±9.989.37±6.4

实验中不存在显著差异,小麦91921824分化率显著

高于89227和中88375(89227分化率t=4.64,中88375分化率t=3.58,临界值t0.05=2.45),同样咸农四号分化率也显著高于89227和中88375(89227分化率t=4.1589,中88375分化率t=2.98,临界值t0.05=2.45).由此可见基因型是影响愈伤诱

中88375

91921824

咸农四号

　　注:愈伤诱导和分化实验每个处理的重复次数分别为5次和4次

导及分化的重要因素.

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图3　预处理对小麦成熟胚出愈率及分化率的影响(愈伤诱导和分化实验每个处理的重复次数分别为5次和4次)

Fig.3　Effectsofpretreatmentonformationanddifferentiationofcallusfrommatureembryosofwheats

2.4　不同激素对小麦愈伤组织分化的影响

将小麦咸农四号成熟胚愈伤组织转到不同激素

组合的分化培养基上进行分化培养,经过10d左右愈伤组织开始分化出绿色芽点,20d产生绿苗,分化培养25d左右调查分化情况其结果见表2.咸农四号成熟胚愈伤组织在分化培养基⑥、⑦上分化能力比较高,分化率分别为22.98%、22.76%,经t检验不存在显著差异.

表2　小麦咸农四号愈伤组织在不同分化培养基上分化情况

Tab.2　Resultofdifferentiationofcallusfrommatureembryo

ofXiannong4culturedindifferentmediums

实验中我们发现咸农四号的愈伤组织较其它品种

大,而89227的愈伤组织较其它品种小,这说明小麦不同品种间愈伤组织在质量上也存在一定差异,并且诱导率高的品种其愈伤组织质量不一定好.愈伤组织的芽再生情况是反映愈伤组织质量的重要指标.凡是分化芽点的愈伤组织一般都表现为色泽新鲜、质密、活力较旺盛.由成熟胚来源的愈伤组织,除少数品种中个别愈伤组织块表现较好外,绝大多数质量都很差.成熟胚分化率最高的91921724为18.73%,但其出愈率并不高;出愈率相对较高的89227分化率却仅有6.88%,因此我们认为小麦成熟胚愈伤组织的诱导频率与分化可能不具备相关关系.

在小麦愈伤组织形成过程中,培养基中2,42D浓度是关键因素,因此在愈伤组织诱导试验中分别设计了6个2,42D浓度梯度.实验结果表明:在2,42D浓度小于8mg/L(或4mg/L)时出愈率随2,42D质量浓度的升高而增大.在随后的分化培养中我们还发现2,42D浓度小于4mg/L时诱导的愈伤组织分化情况较好,所以我们认为小麦成熟胚诱导愈伤组织发生时应当选用4mg/L以下的2,42D浓度为宜.因为判断诱导培养基的优劣,不仅要看愈伤组织诱导率,而且还要看所得愈伤组织的分化能力.当2,42D浓度较高时,得到的愈伤组织可能比较难于分化.

小麦中88374和91921724的出愈率比较低,因此我们采用低温及CaCl2对小麦成熟胚进行预处理.据报道,低温、CaCl2、PEG等处理具有增加种子核酸含量、诱导其蛋白质合成、使种子从休眠状态转向萌发状态的效应[8].我们的实验结果显示:不同预处理对小麦出愈率的影响与小麦品种有关.CaCl2

培养基代码①②③④⑤

培养基激素接种数

分化率/%

——

10.92±1.711.32±3.216.32±3.9

NAA(0.5mg/L)62BA(2mg/L)KT(1mg/L)62BA(2mg/L)NAA(0.5mg/L)62BA(2mg/L)KT(1mg/L)62BA(2mg/L)

67726979

⑥6822.98±5.8

⑦NAA(0.5mg/L)KT(1mg/L)

8422.76±6.8

　　注:每个处理的重复次数为4次

3　讨　论

文献报道基因型对愈伤组织诱导及分化有一定

的影响[6,7],本研究的结果和多数的报道是一致的.

　第5期曹　原,等:冬小麦成熟胚愈伤组织诱导及分化　　　　507

处理对两个小麦品种愈伤组织的形成没有显著的效应,这与廖祥儒[9]等报道的结果是一致的,而低温处理对小麦出愈率的影响因品种而异,这与廖祥儒[10]等报道的低温处理促进小麦成熟胚愈伤组织形成的结果不太一致.采用低温和CaCl2处理诱导的愈伤组织在分化培养中表现了很强的活力,尤其是用CaCl2进行预处理,能使愈伤组织的分化能力提高一倍甚至几倍,但是这种现象仅表现在一两次继代后,随着继代次数的增加愈伤组织的分化能力迅速下降.

在成熟胚愈伤组织分化培养时发现NAA虽也是生长素,但一般情况下它只是起促进小麦愈伤组织根状物产生的作用;少量的KT与62BA可有利于维持愈伤组织的致密结构和芽再生状态.

根据以上实验结果,我们认为小麦在进行愈伤组织诱导及分化培养时,应根据品种的不同选择合理的预处理方式,添加不同的激素并选择合适的浓度.通过基因型和培养条件的优化来提高成熟胚愈伤组织的诱导及分化效率,并以它作为转基因材料,理论上是可行的.参考文献:

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tenanceofembryogeniccallusandsuspensionculturesof

wheat(TriticumaeativumL)[J].PlantCellReport,1995,(15):232—237.

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callusderivedfromtheepiblastofimmatureembryosofwheat(TriticumaeativumL)[J].1986,(45):119—124.

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[7]　胡　含,王恒立.植物细胞工程与育种[M].北京:北

京工业大学出版社,1990.23—32;308—313.

[8]　廖祥儒,朱新产.种子引发提高小麦抗渗胁边能力的

效应[J].植物学通报,1997,14(2):36—40.

[9]　廖祥儒,杜建芳.预处理对小麦成熟胚愈伤组织形成

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[10]　廖祥儒,郭中伟.低温和PEG预处理对小麦愈伤组织

形成及IAA氧化的影响[J].植物学通报,2000,17

(3):257—259.

(编辑:刘志强)

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