线粒体生物学性状及细胞衰老和自噬的研究

线粒体生物学性状及与细胞衰老和自噬的关系

摘要：线粒体除了为细胞生理活动提供能量外，还参与了其他生命过程的调控。线粒体DNA 是哺乳动物细胞内唯一的核外遗传物质, 具有独特的生物学特性, 由于其裸露无组蛋白保护且缺乏有效的修复系统, 易受外源性因素影响发生突变并且在细胞内累积。从线粒体呼吸链逸出形成的活性氧导致线粒体膜通透性升高，线粒体跨膜电位降低，ATP合成减少，持续的活性氧氧化作用使线粒体DNA 损伤增多，导致线粒体结构功能严重受损，促进细胞衰老甚至死亡，线粒体DNA 突变在人类衰老及许多退行性变疾病中的作用已被广泛证实, 退行性变化往往会诱导自噬的有关潜力。在这里,我们讨论了线粒体生物学性状及自噬和衰老之间的关系和影响,以及可能因素调解抗衰老作用和自噬的机制。

关键词:线粒体，DNA突变，活性氧，细胞衰老，自噬作用

Abstract: In addition to providing energy for the cell mitochondria physiological activities, but also involved in the regulation of other life processes. Mitochondrial DNA in mammalian cells is the only genetic material outside the core, has a unique biological characteristics, mutations due to its non-histone proteins exposed the lack of effective protection and repair system vulnerable to exogenous factors and accumulate within the cell. Reactive oxygen escaping from the formation of the mitochondrial respiratory chain, resulting in mitochondrial membrane permeability increased, reduced mitochondrial transmembrane potential, ATP synthesis decreased ROS continuous oxidation increased mitochondrial DNA damage, causing serious damage to mitochondrial structure and function, and promote cell aging and even death, mitochondrial DNA mutations in human aging and many degenerative diseases role has been widely demonstrated degenerative changes tend to be related to the potential of inducing autophagy. Here we discuss the biological characteristics and mitochondrial autophagy and the relationship between aging and influence, as well as aging effects and mediate the anti-aging effects of

autophagy.

Keywords: mitochondria, DNA mutation, reactive oxygen species, cell senescence, autophagy

线粒体是真核细胞内特殊的细胞器，除了为细胞生理活动提供能量外，还参与了其他生命过程的调控，如细胞凋亡、细胞内钙平衡、活性氧(reactive oxygen species, ROS) 产生等等。以往的研究表明，线粒体是一个动态的架构，持续地分裂与融合以维持其完整性[1]，平衡的破坏和线粒体嵴形态学的改变与多种病理过程和疾病相关，如线粒体DNA 缺失与突变以及ROS 产生过多参与细胞老化[2]，线粒体基因表达下降以及线粒体结构破坏与人体发育异常有关[3].

1. 衰老与自由基理论

在1956年哈曼首次提出了衰老与自由基理论，认为生产细胞内活性氧（ROS）是寿命的主要决定因素。影响细胞和器官的功能，以及在老年相关的退行性疾病可能归因于ROS的各种细胞成分的有害作用。ROS在线粒体内通过细胞内的多种酶，如在质膜NADPH氧化酶，过氧化物酶体中的脂质氧化酶，经过线粒体内的氧化磷酸化和细胞质中黄嘌呤氧化酶的催化下生成的[4]。主要包括超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(HO.)、一氧化氮(NO.) 等。线粒体是ROS 的主要产生部位，在线粒体呼吸过程中会有少量的电子从线粒体电子传递链复合体Ⅰ和Ⅲ中漏出，与O2 结合生成ROS。过量的ROS 会对蛋白质、核酸和脂质等生物大分子造成损伤，从而影响其正常生理生化功能。生物体本身存在清除ROS的体系，包括SOD 酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、抗坏血酸等，这一体系使生物体内ROS保持在对机体无害作用。

2. 细胞衰老与线粒体生物学性状

2.1 细胞衰老

细胞衰老是细胞结构和功能的改变积累至一定程度的后果。功能上，表现氧化磷酸化减少，呼吸速率减慢，酶活性及受体蛋白降低，导致细胞功能降低，细胞的增殖出现抑制，其生长停滞在细胞G1期，不能进入S期，或停滞在有丝分裂后期。形态上，不规则的和不正常分叶的核、多形性空泡状线粒体、内质网减少，高尔基体变形，色素、钙、各种惰性物质沉积，常有细胞膜性结构改变，如膜脂过氧化。而上述变化往往是由于细胞新陈代谢障碍引起的。

2.2 线粒体在细胞衰老过程中的作用

线粒体是通过氧化磷酸化高效产生ATP的精密装置，生命活动所需能量的80%-90%由线粒体提供，所以它是细胞进行生物氧化和能量转换的主要场所。有研究结果表明，在衰老过程中，线粒体呼吸功能逐渐下降，并与脑、心脏、肌肉、内分泌系统及其他分裂期后组织和衰老有关的功能下降有着密切关系，并可能进一步引起机体自由基平衡的破坏，逐步导致全身性生理功能的下降。

2.3 线粒体DNA 突变

人类线粒体DNA( mitochondrial DNA, mtDNA) 是由16 569 个碱基对构成的双股环状闭合DNA,存在于线粒体基质中, 是人类独立于核基因组DNA 外的唯一基因组DNA。mtDNA 的重链和轻链均有编码功能, 包含有37 个基因, 分别编码12S 和16SrRNA、20 种tRNA( tRNASer和tRNALeu均有双份基因) 及13 个与线粒体氧化磷酸化有关的蛋白质。mtDNA 上无内含子, 但有一个长1- 2 kb 的非编码区, 称为控制区, 也叫取代环 (D-loop) , 含有转录及复制的调控信号。人体不同细胞类型含线粒体数目不同, 有的含数百个甚至上千个, 也有不含线粒体的细胞如成熟的红细胞, 每个线粒体中有2- 10 拷贝的mtDNA 分子。

体内外多种因素可造成mtDNA 突变。在可能导致mtDNA 突变的环境有害因子中, 活性氧自由基最为重要。线粒体在呼吸链代谢中产生的超氧离子和电子转运中产生的羟自由基, 使DNA 链上的脱氧鸟苷( dG) 转化成8- 羟基脱氧鸟苷( 8- OH- dG),随后在DNA 复制中可诱发点突变。点突变的产生,提高了mtDNA 双链的分离机会, 促使mtDNA 发生进一步突变, 如缺失和重排。重排是发

生在缺失之后的事件。缺失的mtDNA 片段, 既可能形成细胞内的小环, 也可能在mtDNA 或nDNA 上造成重排。 因而, 体内外各种引起自由基产生增多的因素均可引起mtDNA 突变。

持续的活性氧氧化作用使线粒体DNA 损伤增加，导致翻译多肽链错误，这些错误在细胞分裂时被随即分布，使线粒体呼吸链及氧化磷酸化功能受损，其结果使线粒体功能严重受损，引起维持细胞生理、生化活动所需能量的供应不足，导致组织、器官功能的衰退，促进机体衰老。目前研究认为，老年及退行性疾病中，线粒体功能的异常与线粒体DNA 突变有关。线粒体DNA 具有很高的突变率，与衰老相关的线粒体DNA 突变主要有缺失、重排和点突变，其中线粒体DNA 点突变和缺失突变发生频率最高。有关线粒体DNA 点突变与衰老关系的研究报道很少。成人组织突变率为0.05%-0.10%，至少较婴儿组织的0.01%-0.025%高5-10倍。因此线粒体DNA某些点突变可能成为人类老化的重要因素。但目前对于正常人衰老过程中特异性的线粒体DNA 点突变是否会累计还存在着争论[5]。

2.4 mtDNA 突变的生物学效应

mtDNA 主要编码与细胞呼吸链有关的多肽成分及多种rRNA、tRNA, 其缺陷必然干扰氧化磷酸化的过程, 影响细胞维持线粒体膜电位及调节钙离子内流的能力。线粒体在细胞中的多种功能使mtDNA突变生物学效应更为复杂。mtDNA 突变后所产生的生物学效应有两种模式: 细胞生物能阈值模式和细胞程序性死亡模式。在细胞能量代谢方面, 由于mtDNA 的异质体特性, 相关功能的障碍是否出现与缺失或突变的mtDNA 所占比例及突变的位点有关,这个比例一般是50% - 90%, 比例多高, 即阈值效应的出现与突变的类型及组织的耐受性有关。在线粒体肌病中, 活检标本中4 977bp 缺失的比例必需达到20% - 80%, 机体才表现出相关的临床症状。

发生在mtDNA 结构基因上的突变, 大多与细胞呼吸功能有关, 这些突变可通过选择性扩增和累积,产生呼吸链局部障碍, 导致生物能的缺陷, 从而损害多种生理过程。而发生于非编码区的突变, 则可能由于突变使该细胞mtDNA 聚合酶出现差错或出现类似细菌的失事信号( save our ship, SOS) 反应, 激活细胞中的相关基因, 使细胞突变的mtDNA 得到优先扩增而使细胞具有生长优势,

这在人类直肠癌中对同源或近源的mtDNA 突变研究中得到部分证实。

活性氧种( reactive oxygen species, ROS) 是呼吸链的毒性负产物, 呼吸链的障碍同时也使ROS 内源性产生增加, 使生物能的缺陷进一步加重。生殖细胞种系突变特别是患有线粒体病能加速这一病理过程, 导致早衰。而在正常个体中,mtDNA 氧化损伤和体细胞突变累积到一定程度, 表达后则产生衰老、退行性变、肿瘤等[6]。线粒体也是诱发凋亡的开关, 生物能缺陷、自由基产生增多均可诱导细胞发生凋亡从而使组织中细胞大量丢失, 引起组织功能的减退和障碍。

尽管已经有相当多的疾病被证实是mtDNA 突变引起的, 但在mtDNA 突变中, 更多是对机体无害的也无益的所谓中性突变, 加上野生型线粒体的补偿作用也对发生了mtDNA 突变的细胞起到保护作用，这就使mtDNA 突变时, 并不立即产生严重后果。体外实验表明, 带有突变的mtDNA 的细胞并非只能向恶性方向发展, 细胞复制分离过程中, 有相当部分具有形成野生型同质体的倾向。但mtDNA突变型的复制速度往往超过野生型, 这是突变累积的另一重要原因。总之, 补偿和累积是对立的, 不同的组织或细胞可能有较大的差异。

3. 细胞自噬

3.1 细胞自噬的分类

自噬是生物体通过溶酶体或囊泡降解胞内成分的总称，不但在细胞的分化和成熟过程中起重要作用，而且在应对各种应激时也发挥着关键作用。自噬主要有两种形式：大自噬即所谓的自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬。

大自噬通过双层膜结构包裹胞浆内物质，如蛋白及细胞器，形成自噬囊泡，自噬体的外膜或者液泡膜与溶酶体膜融合形成自噬溶酶体，溶酶体内的水解酶最终降解其包裹的底物。小自噬是溶酶体膜通过内吞作用直接包裹胞浆内物质。悦酝粤途径只能选择性降解带有特定信号基序赖原苯丙原谷原精原谷氨酰胺序列的胞浆蛋白，胞浆内的伴侣蛋白特异性地识别这种信号基序然后与溶酶体膜

上的受体溶酶体结合性膜蛋白圆葬结合从而将底物转运到溶酶体内降解。

尽管，自噬最初被认为是非选择性的降解过程，但目前的研究认为自噬可以通过优先降解胞内过多的细胞器即选择性自噬，如过氧物酶体自噬、内质网自噬和线粒体自噬等，从而在机体应对各种应激过程中发挥重要作用。其中和氧化最密切的是线粒体自噬。

图1。

选择性和非选择性自噬示意图

三个不同的细胞自噬的模式是巨自噬，微自噬和分子伴侣介导的自噬。取决于底物的特异性，自噬作用可以是选择性或非选择性的过程。在非选择性自噬，细胞质的一部分被隔离成一个双膜自噬体，然后与溶酶体/液泡融合。与此相反，过氧化物酶体在一定条件下的特异性降解可以由一个大的或微自噬状模式来实现，称为微自噬元。原子核的微自噬允许核的一部分的降解。线粒体的特异性降解，称为线粒体自噬的发生[7]。

3.2 自噬与ROS的关系

细胞自噬过程常常会伴随着ROS 含量的变化，能够诱导自噬的药物，也能导致细胞内ROS 含量的改变。例如脂多糖类(LPSs) 和泛半胱天冬酶抑制剂苄氧羰基-Val-Ala-Asp (Z-VAD) 能够诱导

巨噬细胞产生自噬，并且会使其ROS 含量升高。此外在营养缺失以及疾病过程中产生的自噬同样伴随着细胞内ROS 水平的变化。如果用抗氧化剂降低ROS 的含量，自噬水平会降低[7]。如在癫痫持续状态下的小鼠细胞内，自噬水平升高，产生过量ROS，施以维生素E，细胞内ROS 含量降低，自噬受到部分抑制。这些情况表明ROS与自噬之间存在密切关系，主要表现在以下两方面。

3.2.1 自噬降低ROS毒性

正常情况下，生物体内的ROS 处于较低水平，低水平的ROS 在信号转导、免疫反应以及基因的表达调控过程中起着重要作用，而ROS 的过量累积则会对细胞造成毒性伤害。细胞内的蛋白质能够被ROS 氧化，丧失正常的功能并累积产生毒性。由于线粒体是ROS 的主要来源，且线粒体DNA 比核DNA 更加脆弱，因此线粒体更易遭受ROS 的攻击而产生损伤。过量的ROS 还会使线粒体发生去极化损伤，导致线粒体自噬。线粒体自噬是一个特异性的选择过程，是细胞清除受损线粒体，维持自身稳态的重要调节机制。但线粒体自噬也有可能会促进细胞凋亡。自噬作为细胞在不利环境下的一种存活机制，可通过清除被ROS 损伤的细胞器或蛋白质，降低ROS 对细胞的毒性伤害，保护细胞。但有报道认为，自噬的激活也可加剧ROS 的累积。另外在动物水平，如果体内固有的ROS 清除系统发生异常，致使ROS 累积，那么机体会补偿性地提升自噬水平来降解ROS。

3.2.2 ROS介导自噬发生

ROS 可诱导自噬并在自噬过程中起重要作用，多种情况能够引起细胞内ROS 的增加，进而检测到自噬标志物LC3-II 的累积。一些外源物质通过刺激细胞产生ROS，进而诱导自噬。例如槟榔提取物和线粒体电子传递链抑制剂等能够引起癌细胞中ROS 水平升高，诱导自噬产生，苯并恶嗪衍生物DBO 通过促使胞内ROS 水平升高诱导自噬；直接添加H2O2 也会诱导自噬产生。另外在一些疾病中，内源性的ROS 水平也会升高，引起自噬，如在坏死性小肠结肠炎疾病中， 肿瘤坏死因子TNF-α可以显著的造成线粒体功能异常，进而产生大量ROS，诱导线粒体自噬的产生[8]。

3.3 ROS介导的自噬与疾病

随着对自噬研究的不断深入，越来越多的研究表明自噬与多种疾病有关联，而在一些疾病中也检测到较高水平的ROS。在肿瘤、动脉粥样硬化、神经退行性等疾病中，ROS诱导的自噬对疾病的产生和发展有着重要作用。

3.3.1 肿瘤

肿瘤细胞普遍处于缺氧状态，缺氧诱导因子 (HIF-1) 在细胞对缺氧的应答中起关键作用。在氧含量正常的情况下蛋白酶体降解HIF-1，抑制其活性，但在肿瘤细胞中线粒体产生的 ROS 可以使HIF-1 稳定的存在。HIF-1 能够活化BNIP-3(Bcl-2/E1B-19K-interacting protein 3) 和NIX(BNIP3 类似物)，活化的BNIP-3 和NIX 与Beclin-2 结合，释放Beclin-1 诱导自噬产生，自噬可以减少ROS 的生成和线粒体的聚集，有利于肿瘤细胞在缺氧条件下存活，对肿瘤有促进作用；饥饿或者雷帕霉素处理的HeLa 细胞自噬过程中活化的NADPH 氧化酶产生的ROS 能够激活JAk2/STAT3(Janus 激酶/ 信号转导子与转录激活子3) 途径，自噬过程通过活化JAk2/STAT3 和随后分泌的生长因子促进癌细胞存活。Red-Br-nos( 微管蛋白结合物诺斯卡品的类似物) 能够诱导前列腺癌细胞PC-3 产生自噬，并释放ROS，清除ROS 会降低自噬水平。在多发性骨髓瘤细胞中，HYD1( 一种D- 氨基酸肽) 诱导的自噬有助于癌细胞的存活，ROS 清除剂N- 乙酰-L- 半胱氨酸能够抑制HYD1 诱导的自噬，这些均表明ROS 在癌细胞自噬的产生过程中起重要作用。

3.3.2 动脉粥样硬化

动脉粥样硬化斑块源自血管系统内溶酶体应对氧化损伤的反应。氧化低密度脂蛋白转运胆固醇聚集到动脉壁内，随后巨噬细胞迁移到胆固醇积聚的位置通过溶酶体来包裹清除氧化的蛋白。最后巨噬细胞内溶酶体碱性化导致溶酶体内未降解物质的积聚，巨噬细胞充满了超载的溶酶体，成为吞噬活性有限的“ 泡沫细胞”。研究表明氧化的胆固醇及砸韵杂在动脉粥样硬化的进展中发挥重要作用，氧化的胆固醇通过损伤溶酶体从而影响自噬对于泡沫细胞的清除，而砸韵杂随着损伤细胞及胞外碎片的积聚而增加，从而使病变一直存在。

3.3.3 阿尔茨海默病

阿尔茨海默病是老年人最常见的神经退行性疾病，它的病理学特征为胞内具有毒性的肽片段的聚集。研究表明在聚集的早期就发现有大自噬的激活，并作为一种保护性机制阻止细胞进一步损害。随着疾病的进展一方面自噬的活性下降且自噬溶酶体的融合障碍；另一方面抑制溶酶体的降解功能使肽片段的聚集很快达到毒性水平，导致溶酶体内产生ROS。而过多的可以抑制自噬体对其内物质的降解从而加剧内容物的积聚，使溶酶体膜内外的质子梯度改变并引起细胞死亡。尽管ROS参与了自噬介导的细胞死亡，但其在发病中的具体机制仍有待于进一步阐明[9]。

3.3.4 神经退行性疾病

自噬能够清除并降解在帕金森病(PD)中产生的有害蛋白质。许多情况下，在神经退行性疾病中能够观测到氧化应激增强及ROS 的生成，造成自噬水平的升高。例如在多巴胺D(2) 受体敲除的PD 小鼠模型中，氧胁迫(oxidativestress) 的增强和聚合α- 共核蛋白的形成(α-synuclein)与升高的自噬水平相关。PD 患者的外周血单个核细胞(PBMC) 中经硝基酪氨酸(NT) 修饰的α- 共核蛋白的聚集性增强，其含量与细胞内ROS 的浓度相关，而且PBMC 中自噬水平显著升高。

4. 衰老

衰老是一种不可避免的生理现象，细胞和组织中的不利变化随时间流逝而不断积累引发衰老，其自噬功能会不断减弱，最终会导致死亡。在一些长寿命细胞内，如心肌细胞、神经元细胞，脂褐质会随时间不断产生并沉积下来，阻碍线粒体的自噬，致使衰老的线粒体累积，产生更多的ROS，氧化应激的不断增强，反过来继续损伤线粒体和溶酶体，激发促凋亡途径，最终导致细胞死亡。因此，清除损伤线粒体的自噬，即线粒体自噬有抗衰老的作用。此外，在衰老的酵母细胞内，人类精液中的亚精胺组分能可通过抑制组蛋白酰基转移酶 (HAT) 活性而触发组蛋白 H3 的渐进性脱乙酰基作用，进而抑制氧化应激。这种染色质乙酰化状态的变化能上调多种自噬相关的转录物，促进自噬水平升高，从而延长寿命[10]。

5. 小结与展望

综上所述，线粒体不仅与能量的产生有关，其产生的ROS在一定范围内对机体有积极作用，但过量的ROS 会诱导线粒体DNA的突变以及自噬型细胞死亡，对机体产生不利影响。尽管许多ROS 介导的自噬产生途径被发现，但是对完整的信号转导途径仍缺乏清晰的认识，需要不断深入研究，以完善相关信号通路。另外存在多种ROS，它们是单独的调控自噬，还是一起作用于自噬，存在争论。需要找到或开发出更为精确的探测和标记各种ROS的方法，以便更为准确的认识它们各自在自噬中的具体作用。可以看到，ROS 和自噬在细胞内的作用非常广泛，信号通路异常复杂，而且与人类健康密不可分，但将现有的并不完整的理论应用到临床治疗上是非常危险的，在这方面应当谨慎对待。同时对于肿瘤的研究和治疗也有很大的价值，已有研究证实一些药物可以通过引起ROS增多而上调自噬以杀伤肿瘤细胞。ROS诱导的自噬性细胞存活和死亡之间的关系仍待于进一步研究。

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–544.

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