第３Ｏ卷第５期 食品与生物技术学报 Ｖ０Ｌ ３Ｏ ＮＯ．５ ２０１１年９月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉ０ｔｅｃｈｎｏｌ０ｇｙ Ｓｅｐｔ ２０１１ 文章编号：１６７３—１６８９（２０１１）０５—０７７３—０６ 竹黄菌液态发酵产漆酶培养条件的优化 胡艳 ， 蔡宇杰¨ ， 廖祥儒 ， 马文寅 ， 李枝玲。， 张大兵。 （１．江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡２１４１２２；２． 江南大学生物工程学院，江 苏无锡２１４１２２；３．江苏汉邦科技有限公司，江苏淮安２２３００１） 摘 要：分离筛选到一株产漆酶的竹黄菌，采用单因子相互比较法，研究了该菌株的最适发酵产酶 条件。确定了最适的碳源为２ ｇ／ｄＬ可溶性淀粉、最适的氮源为０．８ ｇ／ｄＬ的酵母膏，以及最适铜离 子浓度为２．４ ｍｍｏｌ／Ｌ，在自然ＰＨ ５．０，装液量为５０ ｍＬ，３０℃、２００ ｒ／ｍｉｎ摇瓶振荡培养６４ ｈ下， 产漆酶酶活水平达１２０ ０００ Ｕ／Ｌ，比优化前提高近１７倍。该竹黄菌株与已报道的白腐真菌相比， 具有发酵周期短且产漆酶酶活较高的优点。 关键词：竹黄菌；漆酶；发酵 中图分类号：Ｑ ５５ 文献标识码：Ａ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｈｉｒａｉａ ｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａ Ｌｉｑｕｉｄ—Ｓｔａｔｅ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆＯｒ Ｌａｃｃａｓｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＨＵ Ｙａｎ ，ＣＡＩ Ｙｕ－ｊｉｅ 。ＬＩＡＯ Ｘｉａｎｇ—ｒｕ ～． ＭＡ Ｗｅｎ—ｙｉｎ ．ＬＩ Ｚｈｉ—ｌｉｎｇ。． ＺＨＡＮＧ Ｄａ—ｂｉｎｇ。 （１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ： ２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；３．Ｈａｎｂｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ． Ｌｔｄ。Ｈｕａｉａｎ ２２３００１。Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｎｅｗ ｌａｃｃａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ，Ｓｈｉｒａｉａ ｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａ，ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａＩ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ａｎｄ ｌｉｓｔｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ ２ ，ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．８％，ａｎｄ ｃｏｐｐｅｒ ｉｏｎ ２．４ ｍｍｏｌ／Ｌ。ｐＨ ５．０，ｌｉｑｕｉｄ ｖｏｌｕｍｅ ５０／２５０ ｍＬ，３０℃，２００ ｒ／ｍｉｎ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｖ ｏｆ ｌａｃｃａｓｅ ｗａｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ａｔ １２０ ０００ Ｕ／Ｌ ａｆｔｅｒ ６４ ｈ，ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ １７ ｔｉｍｅｓ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏ１． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｗｈｉｔｅ—ｒｏｔ，Ｓｈｉｒａｉａ ｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａ ｈａｓ ｔｈｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｅｒ ｌａｃｃａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｋｅｙ ＷＯｒｄｓ：Ｓｈｉｒａｉａ ｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａ，ｌａｃｃａｓｅ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ 漆酶（Ｌａｃｃａｓｅ，ＥＣ １．１０．３．２）是一种含铜的多 酚氧化酶Ⅲ，该酶最早是在漆树的汁液中发现的， 收稿日期：２０１０－１１－３０ 基金项目：江苏省科技创新与成果转化（重大科技支撑与自主创新）专项引导资金项 目（ＢＹ２０１０１１７）；科技部科技 人员服务企业项目（２００９ＧＪ１００３８）；国家自然科学基金项目（２１０４５００７）。 ＊通信作者：蔡宇杰（１９７３一），男，江苏无锡人，工学博士，副教授，硕士研究生导师， 主要从事生物工程方面的研 究。Ｅｍａｉｌ：ｙｕ＿Ｊｉｅ—ｃａｉ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ ７７４ 食 品 与 生 物 技 术 学 报 第３０卷 故将其命名为漆酶；此后在多种植物、真菌［２ｊ、少数 细菌和昆虫体内均有发现 。。 漆酶属于蓝一铜族氧化酶，其活性中心由４个铜 原子组成．在氧化还原反应中起着决定作用。漆酶 的ｌ型铜原子和氨基酸残基结合成为单核中心，使 酶表现为明显的蓝色。另外，它还包含Ⅱ型和Ⅲ型 铜原子，构成三核中心。Ｉ型铜原子作为初级电子 的接受者，参与分子内的电子传递，把电子从底物 传递到其他铜原子上，然后电子结合于三核位点。 该位点进一步把电子传递给结合活性中心的第二 底物氧分子，使之还原为水，而铜的存在是形成复 合体所必需的¨ｌ１一。它们催化的反应是利用分子氧， 产生的副产物只有水，所以又称漆酶为“生态友善 酶”。 由于漆酶具有特殊的催化性能和宽泛的作用 底物，在生物制浆、生物漂白、以及有毒化合物的降 解等方面具有潜在应用价值，因而引起人们越来越 多的研究兴趣，成为环境保护用酶研究的热点［５。 近年来，人们对漆酶的研究越来越深入，其应用的 泛围也越来越广泛。 尽管漆酶在自然界中广泛分布，但真正具有较 高漆酶产量的菌株并不多，分泌漆酶的真菌主要分 布于担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、多孔菌（Ｐｏｌ— ｙｐｏｒｕｓ）、子囊菌（Ａｓｅｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、脉孢菌（Ｎｅｕｒｏｓ— ｐｒａ）、柄孢壳菌（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）和曲霉菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌ— ｌｕｓ）等属种，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真 菌，研究也较多 。但是大部分真菌发酵周期较 长，使得工业化生产具有一定的局限性。 本研究室前期分离筛选得到的一株竹黄菌 Ｊ， 目前还未见关于竹黄菌产漆酶的相关报道。通过 对其产酶培养条件的初步探究，我们发现培养基组 分对其产漆酶能力具有较大的影响，在优化后的培 养基组分下发酵，漆酶酶活由优化前的７ ０００ Ｕ／Ｉ 提高到１２０ ０００ Ｕ／Ｉ ，提高了近１７倍，且发酵周期 短（６４ ｈ），具有工业化生产的潜力。 ｌ 材料与方法 １．１ 菌种 竹黄菌种（Ｓｈｉｒａｉａ ｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａ）：作者所在实 验室保藏。 １．２培养基 １．２．１ 斜面ＰＤＡ培养基（组分ｇ／Ｉ ） 马铃薯 ２００，葡萄糖１Ｏ，琼脂２Ｏ；ｐＨ值自然，１２０℃灭菌２０ ｍｌｎ。 １．２．２ 种子培养基 即为ＰＤＡ液态培养基。 １．２．３发酵培养基（组分ｇ／Ｉ ） 马铃薯２００，葡萄 糖２０；ｐＨ值自然，１２０℃灭菌２０ ｍｉｎ。 １．３ 方法 １．３．１种子制备 将菌株接种到斜面ＰＤＡ培养 基上，３Ｏ℃恒温培养５～７ ｄ后，观察试管壁上有黑 色孢子生成。取ｌＯ ｍＬ无菌水冲洗种子试管壁 卜 的孢子，取１ ｍＬ孢子菌悬液接种到种子培养基５（） ｍＬ（２５０ ｍＩ 三角瓶），３０℃、２００ ｒ／ｍｉｎ摇床恒温培 养１６ ｈ。 １．３．２液态发酵 取菌悬液接入液态发酵培养基 ５０ ｍＩ （２５０ ｍＩ 三角瓶），接种体积分数１０ ，３０ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ摇床恒温培养６４ ｈ。培养条件的优 化按单因子顺次进行，每次优化结果用于后续实 验。 １．３．３粗酶液的制备 发酵液经１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ、４ Ｃ离心１５ ｍｉｎ，取得的上清液即为粗酶液，适当稀 释后用于酶活测定。 １．４漆酶酶活的测定 漆酶酶活测定以ＤＭＰ为底物，参考Ｌｉｔｔｈａｕｅｒ 等人的测定方法稍做调整［１ 。每３ ｍＩ 反应体系 含：０．１ ｔｏｏｌ／Ｌ柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液（ｐＨ ３．５） ２．４ ｍＬ，０．０ｌ ｍｏｌ／Ｉ ＤＭＰ ０．５ ｍＩ ，６０ Ｃ保温１０ ｍｉｎ后加入０．１ ｍＩ 酶液，在４７０ ｎｍ处测吸光值。 以每分钟氧化１肚ｍｏｌ ＤＭＰ所需要的酶量定义为１ 个酶活力单位（ｅ一４９．６ Ｌ （ｍｍｏｌ・ｃｍ），酶活以Ｕ Ｌ表示）。 １．５生物量测定 发酵培养物经过滤脱水后，用蒸馏水洗涤２ 次，于干燥箱中８０ Ｃ恒温干燥４８ ｈ，用分析天平测 定菌丝体干重。 １．６ ｐＨ值测定 使用精密酸度计（ＳＡＲＴ（）ＲＩＵＳ ＡＧ ＰＢ ｌ０）洲 定。 ２结果与讨论 ２．１优化前产漆酶情况 将培养７ ｄ的孢子接种至液态发酵培养基中， ２００ ｒ／ｍｉｎ、３０℃恒温培养，每８小时取样测定漆酶 活力，结果见图１。菌株在液态发酵条件下，第ｌ天 之后开始慢慢产酶，同时观察到发酵液的颜色逐渐 变红，在第４８小时漆酶酶活有很大的提高，第６４小 时漆酶活力达到最高，因此选择６４ ｈ作为后续发酵 研究的培养时间。 ２．２碳源对产漆酶的影响 碳氮源的种类和浓度不仅是菌体生长的必要 第５期 胡艳等：竹黄菌液态发酵产漆酶培养条件的优化 ７７５ 因素，而且对产酶也有重要的影响。分别用等质量 的乳糖、麦芽糖、果糖、可溶性淀粉、柠檬酸、甘露醇 和蔗糖替代基础液态发酵培养基中的葡萄糖，３Ｏ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ摇床恒温培养６４ ｈ后，测定不同碳源 对漆酶产量的影响，结果见图２。以可溶性淀粉促 进发酵产酶效果最好，柠檬酸严重抑制了漆酶的产 生。因此确定可溶性淀粉为液态发酵产漆酶培养 基的碳源。 ７ ０００ ６ ０００ ５ ０００ 烬 ４０００ 避 溢 ３ ０００ 燎 ２ ０００ １ ０００ Ｏ ０ ８ ｌ６ ２４ ３２ ４０ ４８ ５６ ６４ ７２ ８Ｏ 培养时间／ｈ 图１优化前产漆酶曲线 Ｆｉｇ．１ Ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｃｃａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｅｆｏｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚａ— ｔｉｏｎ 蜒 罐 霞 碳源 图２碳源对产漆酶的影响 Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｌａｃｃａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２．３ 可溶性淀粉质量浓度对产漆酶的影响 将发酵培养基中的可溶性淀粉分别调至不同 的浓度，２００ ｒ／ｒａｉｎ、３０℃恒温培养６４ ｈ后，测定可 溶性淀粉质量浓度对产漆酶的影响，结果见图３。 在可溶性淀粉质量浓度达到２Ｏ ｇ／Ｉ 之前，漆酶活力 随着质量浓度的增加而升高，说明培养基中添加一 定量的可溶性淀粉有利于菌体生长，对漆酶的产生 有促进作用，但可溶性淀粉超过２０ ｇ／Ｌ时，可溶性 淀粉溶解性能不佳，漆酶活力则开始下降。所以， 确定产漆酶的最佳可溶性淀粉质量浓度为２０ ｇ／Ｌ。 淀粉质量浓度／（ｇ／Ｌ） 图３可溶性淀粉浓度对产漆酶的影响 Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ ｏｎ ｉａｃｃａ— ｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２．４氮源对产漆酶的影响 氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸、蛋 白质、核酸等）和含氮代谢物。分别用等摩尔量（２ ｍｍｏ１）的豆粕，玉米浆，酵母膏，牛肉膏，蛋白胨，尿 素，硝酸铵，硫酸铵，酒石酸铵，氯化铵，Ｌ一天冬氨 酸，硝酸钠作为氮源进行初步培养，发现与有机氮 源相比，无机氮源均不利于菌体产酶，尤其是尿素， 硫酸铵和氯化铵明显抑制了酶的产生。然后从中 选取产漆酶较高的６种氮源（豆粕，酵母膏，酒石酸 铵，牛肉膏，硝酸铵，玉米浆）重新发酵培养，结果见 图４。可以看出：酵母膏的作用最为显著，豆粕次 之。 １２０ １ＯＯ 摹８０ 蝗 避６０ 靛 ｑｋ－４０ ２Ｏ Ｏ 露多 移 穆移秽够莎 群 氮源 图４氮源对产漆酶的影响 Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｌａｃｃａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２．５酵母膏质量浓度对产漆酶的影响 在液态发酵培养基中加入不同质量浓度的酵 母膏，２００ ｒ／ｒａｉｎ、３０℃恒温培养６４ ｈ后，测定酵母 膏质量浓度对产漆酶的影响，结果见图５。加入酵 母膏可以明显促进漆酶的产生，当质量浓度为１０ ｇ／Ｌ时，漆酶酶活达到最高，之后随着酵母膏质量浓 度的增大，培养基溶氧下降，漆酶酶活开始降低，说 ７７６ 食 品 与 生 物 技 术 学 报 第３０卷 明酵母膏过量对漆酶的产生有一定的抑制作用。 蜒 避 。露 酵母膏质量浓度／（ｇ／Ｌ） 图５酵母膏质量浓度对产漆酶的影响 Ｆｉｇ．５ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｎ ｌａｃｃａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２．６不同离子对产漆酶的影响 在液态发酵培养基中添加相同浓度的金属离 子，２００ ｒ／ｍｉｎ、３０ Ｃ恒温培养６４ ｈ后，测定不同的 金属离子对产漆酶的影响，结果见图６。可以观察 到，Ｃｕ： 可显著促进漆酶的增加；Ａ１”、Ｆｅ抖、 Ｍｇ 、Ｋ 、Ｎａ 也能微弱地促进漆酶的产生，但促 进程度依次递减；Ｍｎ。 效果不明显；Ｚｎ。 具有明显 的抑制作用。 １Ｏ０ ８Ｏ 蛭６０ 溢 罂４０ ２Ｏ Ｏ ＣＫ ＡＩ Ｃｕ。 Ｆｅ Ｋ Ｍｇ Ｍｎ Ｎａ—Ｚｎ 金属离子 图６ 不Ｉ司金属离子对产漆酶的影响 Ｆｉｇ．６ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ｏｎ ｌａｃｃａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２．７ Ｃｕ 浓度对产漆酶的影响 铜是生物体所必需的微量元素之一，同时在基 凶转录水平中作为辅助因子及调节物参与漆酶的 生物合成，这在糙皮侧耳（Ｐ．ｏｓｔｒｅａｔｕｓ），毛栓菌 （丁．ｐｕｂｅｓ￣ ｅｎｓ）和密孔菌（Ｐ．ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）等菌株的 漆酶转录上已经得到印证ｌｌｊｌ 一。因此，铜离子作为 漆酶合成中一种不可缺少的物质，被认为是漆酶发 酵的有效诱导剂。 在本研究中，在液态发酵培养基中添加不同浓 度的Ｃｕ ，２００ ｒ／ｍｉｎ、３Ｏ Ｃ恒温培养６４ ｈ后，测定 铜离子浓度对产漆酶的影响，结果见图７。添加不 同浓度的Ｃｕ。。。对漆酶酶活有一定的影响，不添加 Ｃｕ 时漆酶酶活较低，浓度为２．４ ｍｍｏｌ／Ｉ 时漆酶 酶活达到最高，之后随着铜离子浓度的升高酶活开 始下降，可以看出高浓度的铜离子对漆酶的产生有 一定的抑制作用。 图７ Ｃｕ 浓度对产漆酶的影响 Ｆｉｇ．７ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ ｉｏｎ ｏｎ ｌａｃｃａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２．８正交试验 采用Ｌ９（３３）正交试验因素水平表进行正交试 验。根据实验设计表１进行９组实验，正交试验结 果方差分析见表２。 表１正交试验设计 Ｔａｂ．１ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌ９（３ ）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｒｒａｙ ｄｅｓｉｇｎ 表２正交实验结果 Ｔａｂ．２ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｌ９（３３）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｒｒａｙ ｄｅｓｉｇｎ 霉 Ａ Ｂ Ｃ 酶活／ （×１Ｏ Ｕ／Ｉ ） ｌ １ ９．Ｏ９ ２ ２ １Ｏ．９４ ３ ３ ８．９３ １ ２ １２．Ｏ５ ２ ３ １１．Ｏ８ ３ １ １Ｏ．２６ １ ３ １０．０１ ２ ｌ ９．９６ ３ ２ ９．８７ ９．６５３ １Ｏ．３８３ ９．７７Ｏ ｌ１．１３Ｏ １０．６６Ｏ １Ｏ．９５３ ９．９４７ ９．６８７ １Ｏ．ＯＯ７ １．４７７ Ｏ．９７３ １．１８３ 第５期 胡艳等：竹黄菌液态发酵产漆酶培养条件的优化 ７７７ 设计３个因素，３个水平，９组实验对发酵培养 优化后的产酶曲线见图８。第１天菌体处于延 基进一步优化。Ａ。Ｂ Ｃ 为最优水平组合，即可溶 滞期，细胞处于适应环境状态，菌体生长缓慢，基本 性淀粉质量浓度为２０ ｇ／Ｌ，酵母膏质量浓度为８ ｇ／ 不产漆酶，ｐＨ值变化不大；第２天菌体的生长进入 Ｌ，Ｃｕ抖浓度为２．４ ｍｍｏｌ／Ｌ。极差分析比较ＲＡ＞ 对数生长期，第３２天菌体的干重开始明显增加，说 Ｒ ＞Ｒ。，即可溶性淀粉质量浓度对产漆酶的影响最 明３２～４Ｏ ｈ是菌体的快速生长繁殖阶段，此时ｐＨ 大，其次为Ｃｕ。 浓度，酵母膏质量浓度对其影响最 值也快速增加到６．５左右，随后ｐＨ值开始下降，漆 小。 酶酶活开始增加，说明菌体开始进入产酶阶段。４８ ２．９优化条件下漆酶发酵动态 ｈ以后细胞生长处于平稳期，漆酶酶活呈现指数增 优化后的发酵培养基为：马铃薯２００ ｇ／Ｌ，可溶 长阶段，ｐＨ值缓慢降低，并呈现波动现象。第６４ 性淀粉２０ ｇ／Ｌ，酵母膏８ ｇ／Ｌ，Ｃｕ。 ２．４ ｍｍｏｌ／Ｉ ， 小时产酶达到最大值，ｐＨ在５．５左右；之后产酶开 在自然ｐＨ ５．０。装液量为５０ ｍＬ／２５０ ｍＬ，３Ｏ℃、 始衰减，由于进入发酵的后期，菌体自溶，ｐＨ又开 ２００ ｒ／ｒａｉｎ摇瓶振荡培养３ ｄ。 始缓慢回升，影响了漆酶的产生以及漆酶的活性。 ６－８ １２Ｏ ０００ ６．６ ｌ０５ ０００ ６．４ ９０ＯＯＯ ６．２ ７５ ０００ 目 ６．Ｏ 蜒 吕 ｉ四 溢６０ ０００ ５．８雹 髓 １１母ｌ１ 赚４５ ０００ Ｈ＿ ５．６ ｛圜 ５．４ ３０ ０００ ５．２ １５ ０００ ５．Ｏ Ｏ ４．８ 培养时间／ｈ 图８优化后的发酵产漆酶过程曲线 Ｆｉｇ．８ Ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉａｅｅａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ 和优化前的产酶曲线相比，两者有着相同的走 理口引，漆酶基因的克隆、异源表达，以及漆酶的产业 势。１）４０～４８ ｈ是菌体生长和发酵产酶的转折 化应用等方面都有了很好的了解，但仍然存在着不 点，之前主要是菌体的生长和繁殖，之后主要是发 少问题。如菌株合成漆酶水平偏低、发酵周期长、 酵产漆酶；２）都在６４ ｈ达到产漆酶的最大值，发酵 不适于工业化生产等。所以，近年来有关漆酶生产 周期短。 方面的研究工作，均围绕提高漆酶的产量而展开， 由图８还可以看出，菌体生长的最适ｐＨ值在 选育漆酶高产菌株和构建产漆酶的工程菌株已成 ６．５左右；发酵产漆酶的最适ｐＨ值在５．５左右，可 为研究热点。 以尝试在发酵过程中通过分阶段控制ｐＨ值和补料 与所报道的诸多产漆酶菌株相比，本竹黄菌株 的办法来进一步提高漆酶的产量。 具有以下优点：产酶发酵培养基配方简单经济，发 酵条件温和，且发酵周期短（发酵６４ ｈ左右漆酶活 ３ 结 语 力即可达到１２０ ０００ Ｕ／Ｌ），符合工业化生产酶制剂 人们对于漆酶的认识已有１００多年了，随着研 的要求，为进一步研究漆酶的性质以及其在工业上 究的不断深入，对于漆酶的活性中心及其催化机 的应用提供了一定的理论依据。 ７７８ 食 品 与 生 物 技 术 学 报 第３０卷 参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）： ［１］王佳玲，余惠生．白腐菌漆酶的研究进展［Ｊ］．微生物学通报，１９９８，２５（４）：２３３—２３６． Ｉ ＩＵ Ｊｉａ—ｌｉｎｇ，Ｙｕ Ｈｕｉ—ｓｈｅｎｇ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｌａｃｃａｓｅ ｆｒｏｍ ｗｈｉｔｅ ｒｏｔ ｆｕｎｇｕｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，２５（４）：２３３— ２３６．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ２］钞亚鹏，钱世钧．真菌漆酶及其应用［Ｊ］．生物工程进展，２００１，２１（５）：２３—２８． ＣＨＡＯ Ｙａ—ｐｅｎｇ，ＱＩＡＮ Ｓｈｉ—ｊｕｎ．Ｆｕｎｇａｌ ｌａｅｃａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００１。２１（５）：２３—２８ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ｒ３］Ａｌｅｘａｎｄｒｅ Ｇ，Ｚｈｕｌｉｎ Ｉ Ｂ．Ｌａｃｃａｓｅｓ ａｒｅ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００，１８（２）：４１—４２． ｆ ４］Ｆａｒａｃｏ Ｖ，Ｇｉａｒｄｉｎａ Ｐ，Ｐａｌｍｉｅｒｉ Ｇ ｅｔ ａ１．Ｍｅｔａｌ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌａｃｃａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，２ ｌ：１ ０ ５— １］］ ５］ 尹亮，陈章和，赵树进．白地霉产漆酶条件优化及对偶氮染料的脱色［Ｊ］．华南理工大学学报：自然科学版，２００８，３６ （１２）：８５—９０． ＹＩＮ Ｌｉａｎｇ，ＣＨＥＮ Ｚｈａｎｇ—ｈｅ，ＺＨＡＯ Ｓｈｕ ｊｉｎ．（）ｐｒｉｍ ｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｃａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ ａｎｄ ｄｅｃｏｌ ｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｚｏ ｄｙｅｓ ｂｙ ｌａｃｃａｓｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００８，３６（１２）： ８５—９０．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） 『 ６ Ｊ梁帅，周德明，冯友仁．白腐真菌漆酶的研究进展及应用前景ＩＪ］．安徽农业科学，２００８，３６（４）：ｌ３１７—１ ３】９． ＩＡＡＮＧ Ｓｈｕａｉ，ＺＨ（）Ｕ Ｄｅｎｇ—ｍｉｎｇ，ＦＥＮＧ Ｙｏｕ—ｒｅｎ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｓｐｅｃｔ ｏｆ ｌａｃｃａｓｅ ｆｒｏｍ ｗｈｉｔｅ ｒｏｔ ｆｕｎｇｕｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００８，３６（４）：１３１ ７—１３１９．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ７］李兵，王宇光．平菇漆酶与Ｃｕ。 调控关系的研究进展［Ｊ］．安徽农业科学，２００８，（０７）：２６６０—２６６１． １ Ｉ Ｂｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｙｕ—ｇｕａｎｇ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌａｃｃａｓｅ ｉｎ Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓａｎｄ Ｃｕ ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００８，（０７）：２６６０—２６６１．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ８］赵林果，陆叶，谢惠芳，等．碳源和氮源对彩绒革盖菌液体发酵合成漆酶的影响［Ｊ］．微生物学杂志，２００７．２７（５）：５７— ６０． ＺＨＡ（）ｉ．ｉｎ ｇｕｏ，ＬＵ Ｙｅ，ＸＩＥ Ｈｕｉ—ｆａｎｇ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏ ｌｏｒ ｌａｃｃａｓｅ ｉｎ ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅＥＪ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，２７（５）：５７—６０．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［９］梁晓辉，蔡宇杰，廖祥儒，等．竹黄发酵菌丝与竹黄子座成分比较分析［Ｊ］．食品与生物技术学报，２００９，２８（５）：ｌ６—２０． ＬＩＡＮＧ Ｘｉａｏ—ｈｕｉ，ＣＡＩ ＹＵ—ｊｉｅ，ＬＩＡＯ Ｘｉａｎｇ—ｒｕ。ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｈｉｒａｉａ ｓｐ．ＳＵＰＥＲ—Ｈｌ６８ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｍｙｃｅｌｉａ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒｏｍａｔａ ｏｆ Ｓｈｉｒａｉａ ｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａ ＥＪ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２８（５）： ｌ６—２０．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ｌ ０ ｌ＿Ｌｉｔｔｈａｕｅｒ Ｄ，ｖａｎ Ｖｕｕｒｅｎ Ｍ Ｊ，ｖａｎ Ｔｏｎｄｅｒ Ａ ｅｔ ａ１．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｌａｃｃａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ（ＳＣＣ １０８）［Ｊ］．Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，４０（４）：５６３—５６８． １ １］Ｇａｌｈａｕｐ Ｃ，Ｈａｌｔｒｉｃｈ Ｄ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｃａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｔｈｅ ｗｈｉｔｅ ｒｏｔ ｆｕｎｇｕｓ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００１。５６（１—２）：２２５—２３２． ：ｌ２］Ｈｏｓｈｉｄａ Ｈ，Ｆｕｊｉｔａ Ｔ，Ｍｕｒａｔａ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｐｐｅｒ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ ｅｃｃｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌａｃｃａｓｅ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ａｎｄ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００５，６９（６）：１０９０—１０９７． ｌ３］万云洋，杜予民．漆酶结构与催化机理［Ｊ］．化学通报，２００７，（９）：６６２—６７０． ＷＡＮ Ｙｕｎ—ｙａｎｇ，ＤＵ Ｙｕ—ｍｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｌａｃｃａｓｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，（９）：６６２—６７０．（ｉｎ （ ｈｉｎｅｓｅ）