绵羊羊膜上皮细胞分离培养及鉴定

Chinese Journal of Tissue Engineering Research April 1, 2012 Vol.16, No.14

绵羊羊膜上皮细胞分离培养及鉴定*☆

朱雪敏，李海军，米 焱，杨银凤，关洪敏，曹贵方

Isolation, culture and identitication of Ovis aries amnion epithelial cells Zhu Xue-min, Li Hai-jun, Mi Yan, Yang Yin-feng, Guan Hong-min, Cao Gui-fang Abstract

BACKGROUND: The amnion epithelial cells (AECs) with stem cells properties have been successfully obtained after isolating, digesting and culturing human and rat amnion and AECs have the potential to differentiate into cells of the endoderm (liver, lung, epithelium), mesoderm (bone, fat), and ectoderm (neural cells),

OBJECTIVE: To obtain the Ovis aries AECs and detect the stem cell characteristics.

METHODS: Ovis aries amnion tissue was peeled off by mechanical way and the low velocity-trypLE (pancreatic enzyme

replacement) digestion method was used to isolate and culture the Ovis aries amnion, and the Ovis aries AECs were obtained. RESULTS AND CONCLUSION: The immunofluorescence observation showed that the labeled protein of AECs such as Oct-4, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60,

TRA-1-81 could be expressed on Ovis aries AECs. RT-PCR experiments confirmed that the genes of Oct-4, Sox-2 and Rex-1 were expressed and Nanog was not expressed. The results indicate that the Ovis aries AECs with stem cells properties have been achieved successfully.

Zhu XM, Li HJ, Mi Y, Yang YF, Guan HM, Cao GF. Isolation, culture and identitication of Ovis aries amnion epithelial cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(14): 2559-2562. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]

Laboratory of Animal Embryo and Developmental Biology, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, Inner Mongolia Autonomous Region, China Zhu Xue-min☆, Studying for

doctorate, Lecturer, Laboratory of Animal Embryo and Developmental Biology, Inner

Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, Inner Mongolia Autonomous Region, China zhuxuemin7195@ 126.com Corresponding

author: Cao Gui-fang, Doctor, Professor, Laboratory of Animal Embryo and Developmental Biology, Inner

Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, Inner Mongolia Autonomous Region, China

guifangcao@ 126.com Supported by: National High

Technology Research and Development Planning (863 Program), No.2008AA101005*

Received: 2011-10-30Accepted: 2011-12-01 摘要

背景：目前有研究发现人羊膜和大鼠羊膜分离消化培养后，可成功获得具有干细胞特性的人羊膜上皮细胞和鼠羊膜上皮细胞，在体外一些外源因子作用下具有向三胚层细胞分化的潜能。 目的：获取绵羊羊膜上皮细胞，并对其干细胞特性进行鉴定。

方法：采用机械方法剥离绵羊羊膜组织，运用低速旋转TrypLE(胰酶替代物)消化法对绵羊羊膜进行分离培养获得绵羊羊膜上皮细胞。 结果与结论：细胞免疫荧光检测结果表明绵羊羊膜上皮细胞表达Oct-4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等胚胎干细胞标记蛋白；RT-PCR技术鉴定结果显示绵羊羊膜上皮细胞的Oct-4、Sox-2、Rex-1全能性相关基因表达，而Nanog基因不表达。检测结果提示实验成功获得具有干细胞特性的绵羊羊膜上皮细胞。 关键词：绵羊羊膜上皮细胞；分离；培养；细胞免疫荧光；RT-PCR 缩略语注释：AECs：amnion epithelial cells，羊膜上皮细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.14.018

朱雪敏，李海军，米焱，杨银凤，关洪敏，曹贵方. 绵羊羊膜上皮细胞分离培养鉴定[J].中国组织工程研究，2012，16(14):2559-2562. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]

0 引言

自Evans等[1]于1981年首次成功分离培养出小鼠胚胎干细胞之后，具有多潜能特性的胚胎干细胞就被广泛应用于发育生物学、基因工程学、人类疾病动物模型的建立和再生医学等许多研究领域。但胚胎干细胞在临床应用中面临一些法律问题和伦理道德问题，且在移植后易出现免疫排斥反应和致瘤性。现在大多数干细胞研究转向具有更大优势的成体干细胞。羊膜上皮细胞是由羊膜衍生的成体干细胞，是解剖学和组织学上的胎儿上皮细胞。

以往多以人羊膜上皮细胞(amnion epithelial cells，AECs)和大鼠AECs为研究对象，包括分离培养诱导分化 [3-5,7-9] [2-4]

乳动物的绵羊，具有丰富的羊膜来源，其生理特征和体格大小与人类相似性高，是良好的临床实验动物。

因此，本实验在绵羊AECs进行分离培养后，对其干细胞特性进行了鉴定，鉴定结果为进一步的细胞诱导分化和临床治疗提供了极有意义的实验依据。 1 材料和方法 设计：细胞观察实验。

时间及地点：实验于2010-06/2011-08在内蒙古农业大学兽医学院实验中心完成。 材料：

绵羊胎盘：无菌采取怀孕3月龄以上绵羊胎 、干细胞特性鉴定

[8,10-14] [3-6]

、盘5个(内蒙古呼和浩特市北亚清真屠宰场提供)，2 h内送达实验室进入实验流程。

、临床治疗研究。作为哺

ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 2559

www.CRTER

.org 朱雪敏，等. 绵羊羊膜上皮细胞分离培养及鉴定

内蒙古农业大学组织胚胎与发育生物学研究室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018

朱雪敏☆，女，1975年生，河南省滑县人，汉族，内蒙古农业大学在读博士，讲师，主要从事动物组织胚胎学与发育生物学方面的研究。 zhuxuemin7195@126.com

通讯作者：曹贵方，博士后，教授，内蒙古农业大学组织胚胎与发育生物学研究室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018 guifangcao@ 126.com 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:1673-8225 (2012)14-02559-04 主要试剂：

试剂

软件进行引物设计，具体见表1。引物由英潍捷 来源

基(上海)有限公司合成。

RT试剂盒，琼脂糖，TaKaRa 大连宝生物工程有限 Ex Taq DNA Polymerase 公司

DMEM/F12 ，胎牛血清， 实验方法：

DL2000 细胞RNA提取试剂盒 上海捷达 美国Invitrogen公司

MEM-NEAA，2-巯基乙醇，青 霉素-链霉素，胰岛素-铁、硒 传递蛋白，TrypLE 胚胎干细胞标志物试剂盒 美国Millipore公司

绵羊AECs的分离与原代培养：采用机械法无菌

分离羊膜和绒毛膜，并轻轻将羊膜上覆盖的卵黄囊剥离弃去，分离好的羊膜置含0.3%庆大霉素生理盐水的无菌瓶中，浸泡1.5 h，然后用DPBS将血迹反复冲洗干净，称重，加入TrypLE (1 mL/g)，37 ℃，100 r/min消化10 min后将羊膜转移到新的无菌瓶中(弃去消化液)，加入TrypLE(1 mL/g)，37 ℃，250 r/min消化30 min，用体积分数为10%的胎牛血清终止消化，

200目不锈钢滤网过滤，收集单细胞悬液。羊膜重复消化2次，合并3次收集的羊膜消化液过滤，滤液置50 mL离心管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清，生长培养基悬浮细胞，以1×106个/瓶接种到T75培养瓶中，置37 ℃、饱和湿度、体积分数为5%CO2的培养箱内进行培养观察，达到80%~90%融合时进行传代。

细胞活力测定：取培养前细胞悬液(3×10) 5

收稿日期：2011-10-30

修回日期：2011-12-01(20110830004/M·C)

RT反应液的组成：5×Prime Script Buffer 2 μL，Prime Script RT Enzyme Mixl 0.5 μL，Oligo dT Primer (50 μmol/L) 0.5 μL， Random 6 mers (100 μmol/L) 0.5 μL，Total RNA 1 μL (≤500 ng)，RNase Free dH2O 5.5 μL。 RT反应条件：37 ℃15 min。PCR反应体系为50 μL：TaKaRa Taq(5 U/μL)0.25 μL，10× PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 4 μL，模板DNA

2.5 ng，P1(20 μmol/L) 1 μL，P2(20 μmol/L) 1 μL，灭菌蒸馏水36.75 μL。 PCR反应条件为：94 ℃1 min；94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，30个循环；72 ℃ 7 min；4 ℃终止反应。

主要指标观察：绵羊AECs生长特点，细胞免疫荧光检测第2代绵羊AECs的胚胎干细胞标记蛋白Oct-4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81表达情况，RT-PCR检测Oct-4、Sox-2、Nanog、Rex-1等全能性相关基因的表达情况。

2 结果 2.1 培养细胞的生长特点 绵羊AECs原代培养6 h后细胞开始贴壁，12 h后大部分贴壁。贴壁前的细胞体积小，圆形透亮，轮廓清晰，立体感和折光性都很强。贴壁后细胞质逐渐展开，折光性变弱。贴壁一两天内细胞增殖缓慢，2 d后增殖迅速，5 d内细胞即达到80%~90%融合，融合的细胞呈膜状生长。细胞贴壁24 h后在倒

P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com

5滴，加入0.4%锥虫蓝5滴，混匀，1~3 min进行观察。计算一个视野中着色的细胞数和细胞总数，测定细胞活力。 绵羊AECs干细胞特性的鉴定：

细胞免疫荧光检测AECs表达胚胎干细胞标记蛋白情况：取培养的第2代绵羊AECs，以1×10 L接种在免疫组化载玻片上，无菌条件下细胞生长过夜。弃去培养基，PBS轻轻冲洗3次；40 g/L多聚甲醛室温固定20 min；PBS冲洗3次，每次10 min(Oct-4用0.35%曲拉通X-100打孔，PBS洗3次，每次10 min)；体积分数为4%的山羊血清室温封闭30 min，吸弃血清，无需冲洗；加入一抗，阴性对照以PBS代替一抗，室温孵育1 h；PBS洗3次，每次10 min；加入二

抗，室温避光孵育40 min；PBS洗3次，每次10 min；DAPI染核，15 min。PBS洗3次，每次10 min；封固，荧光显微镜下观察，照相。

RT-PCR检测全能性相关基因的表达：按照试剂盒说明书提取细胞总RNA。通过DNAStar 2560 8 -1

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置显微镜下可以观察到两种贴壁生长形态，底层紧密贴壁的细胞，黏附贴壁细胞之上生长的圆亮细胞或细胞球状体，少量悬浮生长的圆亮细胞，见图1。 Figure 1 Morphology of passage 2 Ovis aries amnion

2.2 绵羊AECs的干细胞特性鉴定 细胞免疫荧光检测结果显示，绵羊AECs的胚胎干细胞标记蛋白Oct-4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81均呈阳性表达，对照组为阴性，见图2，3。

a -g: FITC labeled Oct-4 (×200), SSEA-1 (×400), SSEA-3 (×400), SSEA-4 (×200), TRA-1-60 (×200), TRA-1-81 (×200) and negative control images under fluorescence microscope, the upper right corner of the figures showed DAPI blue stained nuclei epithelial cells (×100)

图1 第2代绵羊羊膜上皮细胞的生长形态(×100)

a-g: Oct-4 (×200), SSEA-1 (×400), SSEA-3 (×400), SSEA-4 (×200), TRA-1-60 (×200), TRA-1-81 (×200) and negative control images under inverted microscope

Figure 3 Ovis aries amnion epithelial cells (AESCs) under contrast light microscope

图3 绵羊羊膜上皮细胞的细胞相差光镜图

RT-PCR技术检测全能性相关基因的表达情况，见图4。全能性相关基因Oct-4、Sox-2、 Rex-1表达，而Nanog不表达。 M 1 2 3 4

2 000 bp 1 500 bp

750 bp 500 bp 250 bp 100 bp

M: DL2000 DNA Marker; 1: Rex-1; 2: Sox-2; 3: Nanog; 4: Oct-4 571 bp 341 bp297 bp

Figure 2 Ovis aries amnion epithelial cells (AESCs) under immunofluorescence staining

图2 绵羊羊膜上皮细胞的细胞免疫荧光光镜图 Figure 4 Agarose gel electrophoresis of genes 图4 全能性相关基因的琼脂糖凝胶电泳

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CRTER.org 朱雪敏，等. 绵羊羊膜上皮细胞分离培养及鉴定 3 讨论

羊膜衍生的细胞为异质性细胞群，主要包含AECs和羊膜间质细胞两种类型的细胞。在细胞消化过程中，用胰蛋白酶消化羊膜获得的细胞以AECs为主，而用胶原酶消化羊膜获得的细胞主要是羊膜间质细胞。本实验采用了TrypLE(胰酶替代物)低速旋转法获得绵

羊AECs，收集的细胞以绵羊AECs为主，含有少量羊膜间质细胞，传1代或2代后基本纯化。

本实验培养的绵羊AECs呈现分层生长现象，附着在培养瓶底壁的细胞为多角形，细胞核圆形或椭圆形，胞质丰富，细胞呈铺路石样生长。贴壁细胞上生长有圆亮的细胞和少量细胞球状体，这类细胞折光性强，散布存在。上方悬浮细胞圆形，数量较少，折光性很强。结果显示：绵羊AECs在形态上和人AECs相一致。绵羊AECs在传代过程中不能持续更新、永续生长，推测其不表达末端转移酶端粒。AECs末端转移酶端粒的缺失，正是其移植后非致瘤的一个直接原因，但是具体机制目前还不清楚。

通过绵羊AECs免疫荧光图可以观察到：圆亮的细胞和细胞球状体绝大部分表达Oct-4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81等胚胎干细胞标记蛋白，且荧光较强，贴壁细胞则部分表达以上标记蛋白。与报道的人AECs表达胚胎干细胞标记蛋白能力强弱顺序(中间层细胞最强，底层贴壁细胞次之，悬浮细胞最弱)完全相一致[15]。这些观测提示，AECs基底层黏附在培养皿，扮演一个自体饲养层的角色，滋养层作为一个黏附的基底物或是尽可能的分泌一些因子帮助诱导或是供养未分化的细胞。推测可能贴壁的滋养层细胞部分在培养和传代过程中发生分化，从而部分丧失胚胎干细胞标记蛋白的表达能力。人AECs表达胚胎干细胞标记蛋白Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81，而不表达胚胎干细胞标记蛋白SSEA-1[3]。检测绵羊AECs的Oct-4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81胚胎干细胞标记蛋白均有表达，这说明胚胎干细胞标记蛋白SSEA-1在人和绵羊之间的表达存在种属差异。 Oct3/4、Sox2、Nanog是维持胚胎干细胞分化潜能的关键因子，在胚胎干细胞向各种类型细胞分化的过程中逐渐关闭。这些关键转录因子可互相结合于彼此的启动子处，通过上调和下调表达水平，形成一个内在联系的自动调节网络，从而

保持胚胎干细胞的自我更新能力和多向分化潜能[13]。Oct-4是维持细胞未分化状态不可缺少的关键基因，直接决定细胞是否具有分化潜能。Nanog也是维持细胞未分化状态的一个重要因子，但是其更多影响细胞的分化方向，Nanog的缺失往往导致细胞向内胚层细胞分化能力减弱。实验RT-PCR结果显示 2562 [15]

Oct-4、Sox-2、Rex-1表达，而 Nanog不表达。Oct-4、Sox-2、Rex-1在绵羊AECs的表达表明绵羊AECs具有多向分化潜能，而 Nanog不表达，推测绵羊AECs向内胚层分化可能会受限，具体分化能力有待进一步研究证实。 绵羊AECs具有多向分化潜能而因不具自我更新的能力，在传代过程中易衰老分化，所以不是严格意义上的成体干细胞。但其免疫赦免，移植后的非致瘤性和无免疫排斥反应，易获得，不受伦理道德关注等优势，在再生医学和细胞替代治疗的研究中非常具有研究价值。 4 参考文献 [1] [2] [3] [4] [5] [6]

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