动物寄生虫的分子生物学研究进展

动物寄生虫的分子生物学研究进展

作者: 张其艳，杨晓花 来源: 《动物医学进展|云南农业职业技术学院，云南昆明 650212

摘 要：动物寄生虫的分子生物学研究始于20世纪90年代中期，虽然起步较晚，但进展极快。近10年来，研究广度已涉及所有重要的寄生原虫，并已扩展到了具有重要公共卫生意义的部分寄生蠕虫，研究深度已进入寄生虫的基因序列测定分析、分类比对鉴定、诊断方法的建立和免疫学研究领域，建立了近50种寄生虫的cDNA文库。我国鸡球虫、旋毛虫等虫种的分子生物学研究达到和接近世界先进水平。这些研究成果和技术水平，已为动物寄生虫病的研究和防控工作展示了新的前景。

关键词：分子生物学； 动物寄生虫学；相互关系

2004年11月，中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会在广西桂林召开了第五次代表大会暨第八次学术研讨会。会议交流和收录到2002年以来有代表性的重要论文和论文摘要共计247篇(全文84篇，摘要163篇)。其中，应用先进的分子生物学、免疫学和生物化学等现代科学技术，在寄生虫病原基因学和分类学，新型诊断方法的研究探讨和建立，基因功能分析研究和免疫制剂研制等方面的论文和论文摘要就达127篇(全文48篇，摘要79篇)，占论文总数的51.4%[1]。这过半数的论文及论文所显示的学术水平，表明我国在动物寄生虫学和寄生虫病学的研究上，已初步完成了从传统寄生虫学向寄生虫分子生物学研究阶段的过渡，极大的拓展了寄生虫学的研究领域，充分开拓和展示了分子生物学新技术、新方法在寄生虫分类学和寄生虫病诊断及防控上的重要作用和地位。本文就会议的相关论文结合分子生物学的发展情况综述如下。

1 分子生物学发展史的简要回顾

分子生物学是在细胞生物学、生物化学、遗传学和微生物学等学科基础上发展起来的一门进展极快的新兴学科。大体分为3个发展阶段：20世纪50年代前，处于细胞染色体水平的基因遗传学研究阶段；之后，进入DNA大分子水平的基因分子生物学研究阶段；70年代后，DNA的重组和DNA测序技术的发展日趋完善，使分子生物学进入了一个全新的阶段，基本形成了系统的现代分子生物学的理论和实用操作技术体系。其中，最重要的技术发明和技术方法表现为如下几点：

1972年Paul Berg在体外建立了DNA的重组技术，奠定了基因工程的基础。

1973年，Boyer H等首次用质粒克隆DNA，并发现和建立了多种克隆载体；1974年首次实现了异源真核基因在大肠埃希菌中的表达，随之逐步建立了在多种微生物、动物和植物体内的真核表达系统和原核表达系统。

1985年Mulli K等发现可用大肠埃希菌大片段聚合酶在体外扩增单拷贝的哺乳动物基因，完成了体外生物的化学合成基因技术，使DNA片段以2n倍增，奠定了PCR的技术基础。由此建立了许多PCR新技术，如RT-PCR、DD-PCR技术等。可扩增和显示来源于多种细胞或组织的mRNA的cDNA等。1996年又建立了代表性差异分析(RDA)方法，应用于基因差别表达的分析。

20世纪90年代后期，为适应大规模、高通量的基因表达分析，区别不同组织、不同细胞、不同阶段和不同状态下基因表达上的差异，新建立的技术有表达序列标签法(EsTs )技术(吴乃虎，1998)，微点阵基因芯片(micro array)技术(贺林等，2000)，基因表达系列分析(SAGE)技术(王彩虹等，2001)和cDNA微点阵(Schena等，1995)等检测试剂盒或探

针。

1977年Sanger F等发明了双脱氧法测定DNA序列，Maxam A M和Gilbert W也于同年建立了化学修饰法测定DNA。1986年Ansorge W的首台自动DNA测序仪投入使用。1998年《全基因组鸟枪法(whole genomeshotgun)》作为成熟技术实际应用，至2001年，完成了人类基因组和模式生物基因组的DNA测序计划。

分子生物学领域的这些新技术和新方法，在兽医学的病原、诊断、免疫和疫病监测控制等方面都得到了较广泛的应用，取得了一些成果，从一个侧面为分子生物学技术方法的完善和发展作出了积极贡献。

2 分子生物学在动物寄生虫学研究上的应用和成果

2.1 动物寄生虫的分子生物学研究历史概况和主要成果

动物寄生虫及其引发疫病的防治，是预防兽医学领域的重要组成部分。除寄生原虫为单细胞结构、生物学特性较单纯外，其余寄生虫病原体较大，结构较为复杂，在分子水平对其进行生物学研究，比病毒、细菌和原生动物要复杂和困难得多。对寄生虫进行分子生物学的研究大多起步于20世纪90年代中后期，但由于有许多成熟的分子生物学研究技术和方法可供借鉴，所以，寄生虫的分子生物学研究虽然起步较晚，但研究的起点一般都较高，研究进展也较快[2]。

2002年前，国内已对重要的动物和人畜共患寄生虫病原体，如血吸虫、肝片吸虫、猪带绦虫、棘球绦虫、弓形虫、隐孢子虫、球虫、旋毛虫等，利用基因组计划的细菌人工染色体、酵母人工染色体技术，以及芯片技术、聚类分析技术、表达序列标签技术、荧光原

位杂交技术、体内选择技术和同线性分析技术等，对病原寄生虫的核酸、蛋白组成和结构进行了研究，对大部分所研究的寄生虫种构建了某发育阶段或系统发育阶段的cDNA数据库，对部分虫种构建了遗传图、物理图、序列图和基因图。同时，利用PCR及其相关的PCR/RELP、PCR-RAPD、PCR-TRF、PCR-核酸杂交技术、PCR/ISH等技术方法，对部分寄生虫进行了分类鉴定，并对其重要功能基因进行克隆和筛选，已成为诊断和研究寄生虫病的重要手段。同期，国际上对血吸虫基因组的研究较多，也取得了较大的进展。

1998年12月，完成了蠕虫代表种秀丽线虫的基因组测序，为世界最早完成的真核多细胞生物基因组全序列测定。为各种寄生虫利用基因组测序的现代分类学和物种鉴定创造了模式条件。

在分子免疫学方面，Kohler(德国)和Milstein(英国)在1975年成功获得单克隆抗体(McAb)后，现已报告的动物用McAb已有数百种，几乎包罗了流行严重的动物传染病和寄生虫病。在世纪之交，已研制成功了一批重要疫病快速而准确的McAb试剂盒，投入了临床和检测使用。为这些疫病的诊断方法和免疫预防技术展现了可期望的前景。

意大利的Ferrcio R，在细胞因子的研究中发现“热休克蛋白(HSP)”，经对其结构和功能的研究，发现HSP在诱导免疫应答，参与寄生虫分化，抵御寄生虫感染方面有明显作用。国外已对锥虫、利什曼原虫、疟原虫、血吸虫等重要寄生虫的HSP展开了研究。

利用基因重组技术，已研制成功牛巴贝斯虫苗和疟原虫苗，现已发展到基因核酸疫苗的研制。目前，已报道的人用和兽用寄生虫核酸疫苗的实验室研究有疟原虫、血吸虫和利什曼原虫等[3]。

2.2 2002年以来动物寄生虫分子生物学研究的新进展

从总体上看，国内外对动物寄生虫分子生物学的研究在近几年又有了一些新的进展。分子生物学研究的一些最新技术和最新方法开始在动物寄生虫上应用，使研究的范围有所扩大，研究的深度也有所加强[4-5]。

我国寄生虫分子生物学研究对象和范围有所扩大，在过去研究的基础上对鸡球虫的研究已扩展到了几乎所有种、属和其它动物球虫、隐孢子虫。新增了对羊泰勒虫(Theileria SP)、中华泰勒虫(T. sinensis)、牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、绵羊无浆体(Anaplasmaovis)、动物附红细胞体(Eperythrozoon)、伊氏锥虫和犬、猫、牛、羊贾第虫(Giardia)等主要危害种原虫的研究，增加了对土耳其斯坦东毕吸虫、捻转血矛线虫、犬弓首蛔虫、拟地新线虫(P.decipiens)、鸡异刺线虫、猪蛔虫、鸡蛔虫、犬钩虫、盲囊线虫(C.rudolphii)、毛首线虫、犬恶丝虫等寄生蠕虫的分子生物学研究。其中，对鸡球虫、旋毛虫的研究已达到和接近世界先进水平。

建立了一些寄生虫的cDNA文库，开展了部分虫种的分子生物学分类研究。国内一些学者采用RNA抽提、RT-PCR扩增和克隆，进行EnMc-2(Gd)序列分析和与EtMlc-2(Ht)序列比较；或将序列测定结果与登录GenBank的基因进行比对(SI值)等方法，对国内异源、异地的同种或同属不同种的一些寄生性原虫、蠕虫进行了同源性差异鉴定，解决了部分在分类学上有争议虫种的分类学定位问题，在原虫方面表现较为突出。如广东谢明权等对鸡的毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)广东株、北京株，堆型艾美耳球虫(E.acervulina)北京株、广东株的序列比对，证实为异地同源同种；陶建平等对来自国内外不同地区的11株巨型艾美耳球虫(E.maxima)进行RAPD分析，证实为同一种，但有虫株间亲源关系远近差异；安健等也对柔嫩艾美耳球虫4个不同虫株进行了mRNA的差异显示测定，证实有2株同源，有2株为未知新序列。张浩吉等将本地采集的牛附红细胞体的PCR产物进行鉴定测序，结果与GenBank中登录的温氏附红细胞体(E.wenyonii)的同源性为97%；刘琴等用采自水牛的巴贝斯虫进行PCR扩增后的18s rRNA片段测序，结果与GenBank中登录

的15种已知巴贝斯虫均有差异，即定为新种——东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)，修正了原定种为牛巴贝斯虫的结论；罗建勋等用同种方法对我国8株黄牛的巴贝斯虫进行分类鉴定和比对，确定国内巴贝斯虫为牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、大巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种共5个种。翁亚彪等用ITS及5.8 S序列分析，证实国内弓形虫QH绵羊株、ZS人株、SH人株、CN猪株的序列完全一致，与GenBank上登录的RH株也一致，均为同一虫种。另外，以分子生物学的多种方法鉴定，显示我国旋毛虫为2个虫种，即猪的T.spiralis和犬的T.nativa，并确认人的旋毛虫病在南方和中原主要由猪旋毛虫种引起，东北主要由犬旋毛虫种引起。

同时，还完成和建立了2种旋毛虫、部分艾美耳球虫、土耳其斯坦东毕吸虫、温氏附红细胞体、猪囊尾蚴、捻转血矛线虫、牛巴贝斯各虫种和水牛东方巴贝斯虫、绵羊无浆体、弓形虫、羊巴贝斯虫、羊泰勒虫、环形泰勒虫、奶牛附红细胞体广西株、贾第虫、日本血吸虫、肝片吸虫、大片吸虫、拟地新线虫、鸡异刺线虫、异尖线虫、鸡蛔虫、猪蛔虫、弓首蛔虫、犬钩虫、猪毛首线虫等虫种的基因测序；并在国内建立了相应的cDNA文库，为寄生虫分子生物学研究创造和提供了更好的基础条件。

扩大了寄生虫分子生物学诊断和检测方法的应用范围，特别在原虫方面有所突破。但因寄生原虫的同属异种较多，吸虫、绦虫、线虫因虫体较大，结构和生长发育过程复杂等原因。应用分子生物学的一般方法进行大多数寄生虫病的诊断和检测，尚存在准确性、特异性较差，交叉反应不易排除的问题；应用高层次分子生物学技术，又存在成本过高、操作复杂、不易推广等困难。

2 .3 动物寄生虫基因工程疫苗的研究进展

利用现代免疫学、生物化学和分子生物学的理论和方法，进行动物寄生虫疫苗的研究，

近几年也取得了一系列可喜的进展[5]。

目前，囊尾蚴及棘球蚴基因重组疫苗的研制已基本成功。棘球蚴苗EG95可诱导牛产生96%～100%的保护率；羊带绦虫45W-GST融合蛋白重组虫苗，可诱导羊产生92%以上的保护率，对牛无钩绦虫也有较高保护率，该苗即将进入市场。类似的猪囊尾蚴基因重组苗，减虫率和完全保护率已分别达到99.2%和55.5%。猪囊尾蚴细胞苗的研究也已获得成功，使工厂化规模化生产成为可能。

吸虫疫苗研究较多的是日本血吸虫和肝片吸虫，周金春等(2001)用重组的副肌球蛋白(RSJ 97)免疫水牛，3次免疫后腹部贴片感染日本血吸虫尾蚴，结果免疫组减虫率为49.9%，肝脏减卵率为57.3%。另外，发现GST、FABP、膜蛋白(Sjc 23)、卵黄铁蛋(Ferl)等也是血吸虫疫苗的重要候选抗原；GST还具有交叉反应抗原决定簇，对多种血吸虫都具有抗性，使研制广谱抗血吸虫疫苗成为可能。肝片吸虫的GST重组抗原，可使绵羊感染减少48%、牛减少50%。总体看，有效的吸虫基因重组苗在短期内尚难出现。

血矛线虫、食道口线虫、仰口线虫是主要危害牛、羊的一大类线虫，但抗消化道线虫疫苗的研制至今无大的突破。目前，最有效的是用具有氨酞酶A或M活性的110 ku的整合膜蛋白(H11)制作的疫苗，试验效果非常好，在持续23周人工感染下，可使羔羊达到90%以上保护率，但因抗原分子表位含有复合糖成分，难以在常规载体中表达，而无法进行生产性研制。另外，新的抗原虫或抗外寄生虫基因疫苗也处于初始研究阶段。

寻找新有效候选抗原或通过新的优化组合合成新抗原，新的佐剂载体/传递系统的研究，提高免疫保护率，是当前和今后寄生虫基因疫苗研究的方向和热点。

综上所述，分子生物学与动物寄生虫学的关系日益密切，寄生虫及宿主动物相互关系

的分子生物学原理和知识在兽医寄生虫学领域已变得越来越重要，分子生物学技术已经成为研究寄生虫不可缺少的技术手段和方法，应用基因组信息工具将为动物寄生虫学和寄生虫病学的研究提供广阔前景，为保障人、畜健康，促进畜牧业发展发挥重要作用。