７ 第３４卷第３期 《新疆师范大学学报》（自然科学版） Ｖｏｌ－３４．Ｎｏ．３ ２０１５年９月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｐ．２０１５ （Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｄｉｔｉｏｎ） 蓝莓中总黄酮的提取及抗氧化活性研究 古力齐曼・阿布力孜， 阿吾提・艾买尔， 迪丽努尔・马里克 （新疆师范大学化学化工学院新疆乌鲁木齐８３００５４） 捅 要：文章优选蓝莓中总黄酮的最佳提取工艺，考察蓝莓中总黄酮提取液的抗氧化活性。通过单因素试验和Ｌ。（３ ） 正交试验，确定蓝莓中总黄酮的最佳提取条件，通过清除ＯＨ・、ＤＰＰＨ・和０ｉ・以及还原力实验来评价蓝莓中总黄酮体外抗氧化 能力，并与Ｖｃ进行了比较。蓝莓中总黄酮的最佳提取工艺为：乙醇浓度４０％、液料比１：１８（Ｖ：ｍ）、微波功率２５０Ｗ、超声功率 ５０Ｗ、提取温度５５￣Ｃ、提取时间７ｍｉｎ；在此工艺条件下，蓝莓中总黄酮提取率最高，其含量达６．４３３％。抗氧化活性测定结果表明， 蓝莓中总黄酮的抗氧化性明显高于Ｖｃ，而且对ＯＨ・、ＤＰＰＨ・和０ｉ・均有较好的清除能力。该方法简单、快速，蓝莓总黄酮是一 种有效的自由基清除剂。 关键词：蓝莓；总黄酮；超声一微波辅助提取法；抗氧化活性 中图分类号： Ｒ２８４ 文献标识码： Ａ 文章编号： １００８—９６５９（２０１５）０３—００７．０８ 黄酮类化合物是一大类天然产物，是许多中草药的有效成分 Ｊ。它的存在形式有两种，一种是游离的 苷元，另一种是与糖等结合的苷＿２ Ｊ。黄酮的功效是多方面的，它是一种很强的抗氧剂 Ｊ，能改善血液循 环 Ｊ、降低胆固醇。能降低心肌耗氧量，增加冠脉、脑血管血流量，明显缓解心绞痛、抗心律失常等，对防治 心肌梗塞、心律失常等也有重要疗效 等诸多功效，已列为保健食品的一类功能因子。为此，笔者以蓝莓果 实为原料，采用超声一微波辅助提取法研究蓝莓果实中总黄酮的提取工艺，优选蓝莓中总黄酮的提取工艺， 并对提取液进行抗氧化活性研究 ，为利用蓝莓工业化生产黄酮类化合物提供参考依据。 １材料与方法 １．１ 实验材料 １．１．１材料与试剂 蓝莓果实（采自新疆伊宁市）、芦丁准品中（国药品生物制品检定所）、乙醇（９５％）、５％的亚硝酸钠溶 液、１０％的硝酸铝溶液、４％的氢氧化钠溶液、Ｖｃ、ＤＰＰＨ自由基、去离子水、硫酸亚铁溶液（ＡＲ）、双氧水 （ＡＲ）、水杨酸（ＡＲ）。 １．１．２仪器设备 ＵＶ一７５０２ＰＣＳ紫外可见分光光度计（上海京工实业有限公司）；ＲＥ－５２２０旋转蒸发器（上海垒固仪器 有限公司）；Ｕ一３３１０紫外可见分光光度计（日本日立公司）；电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；电热恒 温水浴锅。 １．２实验方法 １．２．１样品的制备 精密称取干燥至恒重的粉碎过的蓝莓果实粉末１．０ｇ于５０ｍＬ圆底提取瓶中，在一定料液比、溶剂浓度、 ［收稿日期］２０１５－０６－０５ ［基金项目］新疆少数民族科技人才特殊培养计划科研项目资助（２０１４２３１２１）。 ［作者简介］古力齐曼・阿布力孜（１９８８－），女，新疆阿克苏人，硕士研究生，主要从事天然产物的研究。 ［通讯作者］迪丽努尔・马里克（１９６４－），女，新疆乌鲁木齐人，教授，主要从事天然产物方面的研究。 ８ 新疆师范大学学报（自然科学版） ２０１５年 温度、功率、提取时间等条件下＿＋浸泡 超声一微波提取 抽滤＿＋浓缩，充分洗净残渣滤干燥后备用。 １．２．２最大吸收峰的确定 精确吸取芦丁溶液３．２ｍＬ，置于１０ｍＬ的容量瓶中，加入３５％的乙醇定容至５．４ｍＬ，加入０．３ｍＬ５％的亚硝 酸钠（ＮａＮＯ：）溶液，摇匀，放置６ｍｉｎ，加入０．３ｍＬ１０％的Ａｌ （ＳＯ ） 溶液混匀，放置６ｍｉｎ，再加入４ｍｌＡ％的氢 氧化钠溶液，混匀，静置１５ｍｉｎ，以空白为对照，立即在４００ｎｍ一６００ｎｍ波长范围内进行扫描，确定其最大吸收 波长。最大吸收波长为５０８ｎｍ。 图１最大吸收波长 １．２．３标准曲线制备及回归方程建立 精确称取芦丁对照品４０ｍｇ置于１００ｍＬ的容量瓶中，加人体积分数为３５％的乙醇定容，精确移取芦丁对 照品溶液０、０．２、０．４、０．８、１．６，２．４、２．８、３．２ｍＬ，用３５％的乙醇定容至５．４ｍＬ，加入０．３ｍＬ５％的ＮａＮＯ２溶液，摇 匀，放置６分钟，加入Ｏ．３ｍＬ１０％的Ａ１２（ＳＯ ），溶液混匀，放置６分钟，再加入４ｍｌＡ％的ＮａＯＨ溶液，混匀，静 置１５分钟，在最大吸收波长处测量吸光度，以吸光度（Ａ）为纵坐标，浓度（Ｃ）为横坐标，绘制芦丁标准溶液 的标准曲线。回归方程为：Ａ＝３．６８１８Ｃ＋０．００１７，相关系数（ｒ＝０．９９８２）。 １．２．４样品总黄酮含量的测定 以蓝莓残渣为原料，经有机溶剂浸提总黄酮，提取液减压过滤后定容至１００ｍＬ，每次准确量取１．０ｍＬ。 代入回归方程（１）中计算，得出提取液中总黄酮含量。 总黄酮提取率（％）＝Ｃｘ１００ｘ１００（ｗ－ｗｘｂ）×１０００ｘ１００ 式中ｗ一样品的重量（单位ｇ）；ｃ一提取液中总黄酮含量（单位ｍｇ／ｍＬ）Ｉｂ一样品的含水量（单位％）。 １．２．５提取条件的优化 为了全面考察超声一微波提取的最佳工艺参数，在单因素实验的基础上，以超声功率、超声温度、料液比 和超提取声时间等４种因素进行Ｌ。（３ ）正交试验，确定最优方案，因素水平如表１所示。 表１因素水平表 １．２．６抗氧化实验 １．２．６．１羟自由基清除率的测定 取７支试管各加入９ｍｏｌ／Ｌ的ＦｅＳＯ ｍＬ，９ｍｏＬ／Ｌ的水杨酸一乙醇溶液ｌｍＬ，样品ｌｍＬ（浓度分别是０．１、 ０．２，０．３、０．４、０．５、０．６）再加入８．８ｍｏｌ／Ｌ的Ｈ２０２ｌｍＬ，放人３７℃水浴中反应Ｏ．５ｈ。以去离子水作为参比，空 白组用去离子水代替样品。以Ｖｃ（抗坏血酸）作为对照物，操作同上，在５１０ｎｍ处测定吸光度，重复做三 次，取平均值代人下式计算清除率。 羟自由基清除率（％）： Ａ未损伤一Ａ损伤 ×１００％ １．２．６．２ ＤＰＰＨ・清除率的测定 第３期 古力齐曼・阿布力孜等 蓝莓中总黄酮的提取及抗氧化活性研究 ９ 吸取不同质量浓度的样品（０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６ ｍｇ／ｍＬ）２ ｍＬ，移入试管中，加０．０４ｍｍｏｌ／ｍＬ ＤＰＰＨ ・的乙醇溶液２．０ ｍＬ，置暗处３０分钟，重复做３次。在５１７ ｎｍ波长处测定吸光度，以空白作参比，按下式 Ａ 一Ａ 计算清除率。 清除率（％）＝ ＿ ×１００％ Ａ０ 式中，Ａ。代表２ ｍＬ ＤＰＰＨ・溶液加入２ ｍＬ无水乙醇； Ａ；代表２ ｍＬ提取液加入２ ｍＬ无水乙醇吸光度； Ａ；代表２ ｍＬ提取液加入２ ｍＬ ＤＰＰＨ・溶液的吸光值。 一曲，８蜀一静 １．２．６．３ ０；・清除率的测定 ∞ 取５０ ｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲溶液（ｐＨ＝８．２）４．５ ｍＬ，加入４．２ ｍＬ去离子水，混匀后在２５℃水浴中保 温２０ ｍｉｎ，取出后立即加入在２５℃水浴中预热过的３ ｍｍｏｌ／Ｌ的邻苯三酚溶液Ｏ．３ ｍＬ（以１０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＨＣ１ 代替邻苯三酚作为空白），混匀后立即倒人比色皿中，于４２０ｎｍ处每隔３０ ８测定吸光度１次，共测５ ｍｉｎ，计 算对照溶液吸光度随时间的变化率Ａ。。然后依照上面方法实验，在加人邻苯三酚前先加人１．０ ｍＬ总黄酮 提取液，再加入３．２ ｍＬ去离子水，其余按上面方法操作，计算总黄酮提取液吸光度随时间的变化率Ａ；。将 Ａ。和Ａ 代人下式计算总黄酮提取液对０；・的清除率 Ａ 一Ａ， 清除率（％）： ＿ ×１００％ Ａ０ 式中Ａ。为空白的平均吸光度；Ａｉ为样品的平均吸光值。 ２结果与分析 ２．１单因素试验结果及分析 ２．１．１乙醇浓度对提取率的影响 １．０ｇ已烘干粉碎处理过的蓝莓果实粉末加１０ｍＬ。微波功率为３００Ｗ，料液比１０：１，超声功率５０Ｗ，乙 醇浓度分别为３０％、４０％、５０％、６０％、７０％。过滤，提取三次合并滤液在４０￣Ｃ一５０￣Ｃ左右浓缩。在５０８ｎｍ处测 定吸光度，结果见图２所示。 ３【Ｊ Ｊ ５０ Ｊ ，（Ｊ 乙醇浓度（％） 图２乙醇浓度因素对提取率的影响 由图２可知，总黄酮提取率随乙醇浓度增大而增大，当乙醇浓度４０％后，提取率开始下降，从成本和得 率来考虑，乙醇浓度为３５％－４５％较为合适。 ２．１．２料液比对提取率的影响 １．０ｇ已烘干粉碎处理过的蓝莓果实粉末加１０ ｍＬ其浓度为分别为６５％乙醇，提取温度５５￣Ｃ。微波功率 为６０Ｗ，超声功率５０Ｗ。其料液比为１：５、１：１０、１：１５、１：２０、ｌ：２５过滤，提取三次合并滤液在４０￣Ｃ一 ５０％左右浓缩。在５０８ｎｍ处测定吸光度，结果见图３所示。 １０ ７０ 新疆师范大学学报（自然科学版） ２０１５焦 ６０ ５０ 吕 墼４ｏ ３Ｏ ２０ ｌ：５ １：１０ ｌ：１５ １：２０ １：２５ 料液比 ＩｌＬ 图３料液比对提取率的影响 由图３可知，总黄酮提取率跟料液比成正比，料液比达到１：１５时，提取率最大；１：１５后，提取率趋于 下降，这是因蓝莓果实中总黄酮含量有限，所以选择料液比１：１０－１：２０为宜。 ２．１．３微波功率对提取率的影响 １．０ｇ已烘干粉碎处理过的蓝莓果实粉末加ｌＯｍＬ其浓度为６５％的乙醇，提取温度５５￣Ｃ，超声功率５０Ｗ， 微波功率分别为ＩＯＯＷ、２００Ｗ、３００Ｗ、４００Ｗ、５００Ｗ过滤，提取三次合并滤液在４０￣Ｃ－５０￣Ｃ左右浓缩。在 ５０８ｎｍ处测定吸光度，结果见图４所示。 ４８ ４６ ４４ 篙４２ 窨 奄｛卜４０ ３８ ３６ ３４ ｌｏ０ ２００ ３００ ４００ ５００ 微波功率（Ｗ） 图４功率因素对提取率的影响 由图４可知，总黄酮提取率随微波功率增大而缓慢升高，在２００Ｗ时趋近于最大值，故选择提取功率为 ＩＯＯＷ－３ＯＯＷ间较为合适。 ２．１．４提取时间对提取率的影响 １．Ｏｇ已烘干粉碎处理过的蓝莓果实粉末加ｌＯｍＬ其浓度为６５％的乙醇，提取温度５５￣Ｃ。微波功率为 ４００Ｗ，超声功率５０Ｗ，提取时间分别为３ｍｉｎ、６ｍｉｎ、９ｍｉｎ、１２ｍｉｎ、１５ｍｉｎ。过滤，提取三次合并滤液在４０￣Ｃ一 ５０￣Ｃ左右浓缩。在５０８ｎｍ处测定吸光度，结果见图５所示。 第３期 古力齐曼・阿布力孜等 ７０ 蓝莓中总黄酮的提取及抗氧化活性研究 ｌ１ ６５ ６０ ∞ ５５ ５０ ４５ ４０ ２ ４ ６ ８ ｌ０ １２ ｌ４ ｌ６ 提取时问（ｍｉｎ） 图５时间因素对提取率的影响 由图５可知，在３ｍｉｎ至６ｒａｉｎ时提取率随提取时间延长而逐渐升高。当提取时间大于６ｍｉｎ时，蓝莓中 总黄酮的提取率下降。故提取时间以５ｍｉｎ－７ｍｉｎ较为合适。 ２．２超声一微波总黄酮提取正交实验 根据单因素实验结果，按照Ｌ （３ ）正交表进行正交实验，正交因素水平如表２所示，实验结果及数据分 析见表２。 表２正交试验设计及结果 ２．３ 注：“ ”表示出现显著性差异 １２ 新疆师范大学学报（自然科学版） ２０１５正 由表２可知，根据极差Ｒ分析，超声一微波辅助提取蓝莓中总黄酮的最佳工艺条件为Ａ，Ｂ ｃ。Ｄ，即乙醇浓 度４０％、提取时间６ｍｉｎ、微波功率１５０Ｗ、液料比１：１８。各因素对蓝莓中总黄酮提取量的影响顺序为：微波 功率（Ｃ）＞料液比（Ｄ）＞乙醇浓度（Ａ）＞提取时间（Ｂ）。从表３方差分析可知微波功率和料液比表现出显著 性差异，而乙醇浓度和提取时间未表现出显著性差异。 ２．４抗氧化实验结果 ２．４．１蓝莓中总黄酮提取液对ＯＨ・的清除作用 利用Ｆｅｎｔｏｎ反应，检测蓝莓提取液和Ｖｃ对ＯＨ・的清除作用，其结果如图６所示。 （％一醉 蜓 鲫 ∞∞ 加ｍ ｏ ０．０ ０．１ ０．２ ０．３ ０．４ ０．５ ０．６ 浓度（ｎｗ，／ｍＬ） 图６蓝莓中总黄酮与Ｖｃ对ＯＨ・的清除作用． 由图６可以看出，在所选质量浓度范围内，提取液和Ｖｃ对ＯＨ・都有一定的清除能力，其效果与添量呈 正相关性。随着浓度的增大，对ＯＨ・清除能力也增加，呈现出较好的量效关系。总黄酮和Ｖｃ对ＯＨ・清除 率的Ｉｃ∞值分别为０．２４ ｍｇ／ｍＬ和０．４５ｍｇ／ｍＬ，总黄酮对羟自由基的清除率比Ｖｃ强约１．８倍。 ２．４．２蓝莓中总黄酮提取液对ＤＰＰＨ・的清除作用 蓝莓中总黄酮提取液对ＤＰＰＨ・的清除作用由图７可看出，总黄酮和Ｖｃ都对ＤＰＰＨ・有一定的清除能 力，而且，其清除能力随着浓度的增加而增大。总黄酮和Ｖｃ对ＤＰＰＨ・清除率的Ｉｃ 。值分别为０．１５ｍｇ／ｍＬ 和０．１７ｍｇ／ｍＬ，蓝莓中总黄酮对ＤＰＰＨ・的清除率比Ｖｃ稍强。 ８０ ６０ 碍 蜒 ４０ ２０ ０ Ｏ．Ｏ Ｏ．１ Ｏ．２ ０．３ ０．４ ０．５ ０．６ 浓度（ｍｇ／ｍＬ） 图７蓝莓中总黄酮和Ｖｃ对ＤＰＰＨ・的清除 ２．４．３蓝莓中总黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用 第３期 古力齐曼・阿布力孜等 蓝莓中总黄酮的提取及抗氧化活性研究 一 静 蜓 Ｏ．０ ０．１ ０．２ ０．３ 【Ｊ．４ ０．５ ０．６ 浓度（ｍｇ／ｍＬ） 图８蓝莓中总黄酮和Ｖｅ对超氧阴离子自由基的清除 蓝莓中总黄酮对０；・的清除能力由图８可看出，总黄酮提取液和Ｖｃ都有一定的清除能力。而且，其清 除能力随着总黄酮浓度的增加而增大。蓝莓中总黄酮和Ｖｃ对Ｏｉ・清除率的Ｉｃ 。值分别为０．３２ｍｇ／ｍＬ和 ０．３８ｍｇ／ｍＬ，总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率比Ｖｃ强约１．２倍。 ３ 结论 正交实验及方差分析结果表明，以蓝莓为原料，采用超声一微波辅助法提取黄酮，研究蓝莓黄酮提取分 离工艺。蓝莓中总黄酮最佳提取工艺条件为：乙醇浓度为４０％、液料比为１：１８、超声功率５０Ｗ、微波功率为 ２５０Ｗ、提取温度５５￣Ｃ、提取时间７ｍｉｎ。在此工艺条件下，蓝莓黄酮提取率达到最大值，即６．６４４％。用法具 有快速、高效、简单、且无污染等特点。 蓝莓提取液的抗氧化活性实验结果表明，蓝莓总黄酮不仅具有较强的还原能力，而且对ＯＨ・、ＤＰＰＨ・ 均有较好的清除能力，且在一定范围质量浓度内对三者的清除作用呈现良好的量效关系。因而可知，蓝莓果 实具有较好的抗氧化活性，可以利用蓝莓的这个特点制作各种抗氧化保健药品，对蓝莓的开发利用有重要意 义，为科研工作者们制作该类药品提供实验基础。 参考文献： 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ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｏｔａ１ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｅｘｔｒａｃｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｏｆ Ｌ９（３ ）ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｆａｙ０ｎ０ｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＯＨ．、ＤＰＰＨ．、０；・ａｎｄ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐｏｗｅｒ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｖｃ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ０ｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖ０ｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｂｌｅｕｂｅｒｒｉｅｓ：４０％ｖｏｌ ｅｔｈａｎｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ｌｉｑｕｉｄ／ｍａｔｅｒｉａｌ ｒａｄｉｏ １８：１（Ｖ：ｍ）、ｕｌｔｒａｓｏｎ— ｉｃ ｐ０ｗｅｒ ｗａｓ ５０Ｗ、ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｐｏｗｅｒ ｗａｓ ２５０Ｗ、ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ５５ ｏＣ、ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ ７ ｍｉｎｕｔｅｓ； Ｕｎｄｅｒ ｓｕｃｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｖｉｅｌｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｗａｓ ６．４３３％．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ０ｆ ｔｈｅ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｂｌｅｕｂｅｒｒｅｉｓ ｗａｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ Ｖｃ，ａｎｄ ＯＨ・，ＤＰＰＨ。，ａｎｄ Ｏ ’ ａｌｌ ｈａｖｅ ｇ１０ｏｄ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｒｅｍｏｖｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｅ、ｑｕｉｃｋ，Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｓ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ；Ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ—ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ