松材线虫伴生细菌与松树萎蔫病关系的初步研究

松材线虫伴生细菌与松树萎蔫病关系的初步研究

作者：李 瑞

来源：《山东农业科学》2010年第04期

摘要：利用3年生黑松苗作接种材料，分别接种消毒后的松材线虫和从线虫体内分离得到的细菌分离物以及线虫与细菌两者的混合物，调查比较发病情况。结果表明，单独接种消毒后的细菌分离物，松树不萎蔫，单独接种松材线虫松树发病枯死，而接种松材线虫和细菌分离物两者的混合物，松树发病更为严重。由此说明松材线虫的伴生细菌对松树萎蔫病的发生有一定作用，但并不是导致松树发病枯死的决定因素。 关键词：黑松；松材线虫；伴生细菌；松树萎蔫病

中图分类号：S763.712.56 文献标识号：A 文章编号：1001－4942(2010)04－0059－03

松树萎蔫病又称松材线虫病，是松树的一种毁灭性传染病，对我国松林资源、自然景观和生态环境造成严重破怀。本试验以3年生黑松为接种材料，以2个地理种即浙江松材线虫Bxzh和葡萄牙松材线虫Bxpo以及分离获得的两个细菌分离物Bzh和Bpo为材料，通过接种实验进行了初步研究，以期明确松材线虫携带的细菌和松树萎蔫病的关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试树种为3年生黑松(Pinwus thunbergii)。

供试松材线虫为浙江松材线虫Bxzh和葡萄牙松材线虫Bxpo，分别来自浙江和葡萄牙。采用单异活体培养法将消毒的线虫接种于生长在PDA培养基上的灰葡萄孢(Bort,yis cinerea)上25℃培养繁殖。接种前，线虫先经0.5％硫柳汞消毒15～20 min，再经0.5％硫酸链霉素消毒15～20 min，最后用无菌水洗3次，移入Eppendorf管中4℃保存备用。

供试细菌，将含有少量松材线虫的水悬液经0.1％硫酸链霉素消毒15～20 min，无菌水洗3次后，于NA培养基(牛肉浸膏0.5％，K2HPO40.5％，琼脂1.5％，pH值为7.0)上25℃下倒

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

置培养。1～2 d后，将长出细菌的培养基放于无菌操作台内进行纯化，从浙江松材线虫Bxzh和葡萄牙松材线虫Bxpo中分别得到细菌分离物Bzh和Bpo，将其加入到NB培养基(NA中不加琼脂)中。27℃、170 r/rain振荡条件下暗培养2 d，平板稀释计数后4℃保存备用。

1.2 接种

采用皮接法。用锋利的刀片在黑松苗基部离地面约5 em处斜切一深达木质部的伤口，然后塞入一块脱脂棉，并用胶布缠紧，上端留一缝隙以便接种。共设9个处理：①线虫：接种消毒后的浙江线虫Bxzh和葡萄牙线虫Bxpo，均为5 000条/株。②细菌：接种细菌分离物Bzh和Bpo，均为3×10CFU/株。③线虫+细菌：每株接种消毒后的松材线虫5 000条及其对应的细菌分离物3×10CFU。④阳性对照：接种未消毒的线虫，均为5 000条/株。⑤无菌水阴性对照。每个处理重复4次。

1.3 病情观察

从接种后开始观察，记载松树发病情况。每隔5 d观察1次，记录发病级数。松苗的病情分级和感病指数的计算按谈家金等(2000)的方法进行。树苗死后，去掉树皮和针叶，分离收集线虫计数并采用Brassh等(1999)提出的方法计算相关寄主适应性(Relative Host Suitability，RHS)系数。

发病级数，根据针叶褪绿枯黄和变红的程度分为5级。0级为针叶正常；I级为部分褪绿1/4针叶变黄；Ⅱ级为2/4～3/4针叶变黄、1/4以下针叶变红；III级为3/4左右针叶变红；IV级为针叶全变红濒临死亡或死亡。

感病指数(IP)=∑(发病株数×代表级数)/(处理株数×最高病级代表值) RHS系数=(接种后松苗死亡百分数×每株死亡松苗分离线虫的平均数)/1000

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

2 结果与分析

2.1 感病进程分析

由表1看出，单独接种细菌分离物Bzh、Bpo及无菌水对照在不同接种时期不发病或发病较轻；除个别时期外，Bxzh、Bxzh+Bzh、Bxzh CK+3个处理在相同时期发病逐渐加重，同处理随接种时间延长其发病总体呈愈加严重趋势。Bxpo、Bx－p0+Bpo、Bpo CK+3个处理的发病规律同上。

2.2 接种后的黑松树苗死亡率

由表2可知，接种葡萄牙线虫分离细菌、浙江线虫分离细菌和无菌水的处理，松树未死亡，而线虫分离其它处理的松枝全部死亡。可以推断，单独接种细菌不能使黑松树苗致死，只有接种了松材线虫或者同时接种了线虫+细菌才能导致黑松树苗萎蔫枯死。

2.3 各处理的RHS系数

由表3可知，分离葡萄牙线虫的RHS系数，处理Bxzh CK+>Bxzh+Bzh>Bxzh；分离浙江线虫的RHS系数变化趋势同葡萄牙线虫；处理Bzh、Bpo、CK一未分离得到线虫，RHS系数为0。RHS系数可以显示黑松对不同线虫群体的适应能力，也可显示不同群体的致病力。可知各处理的RHS系数越大，该处理的致病力也越强。

3 小结与讨论

综上所述，由致死率知，单独接种松材线虫的伴生细菌不能使黑松枯萎死亡，而单独接种线虫或同时接种线虫及其伴生细菌的混合物可导致黑松发病致死；由感病指数和RHs系数知，伴生细菌可加重黑松感病，这一点与国内外的报道有所不同。

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

可见，松材线虫本身对松树的萎蔫起到极其重要的作用，不仅是其伴生菌的载体，其在树体中的繁殖移动很可能对树体造成了破坏，从而导致树势下降。如果在此时遇到高温干旱等逆境胁迫，松树死亡会更高。

用无菌线虫接种的松苗发病速率明显减慢。最终分离到的线虫数少于原接种量。对这一现象的可能解释是：(1)松材线虫的所谓伴生细菌在线虫的生活力上有极其重要的作用；(2)在消毒过程中，链霉素或硫柳汞对线虫的生活力造成了一定的影响，从而使得线虫的繁殖力下降。