４９０・主堡塞墼塑！堕压痘壹堂苤查！！！！至！！旦笙！！鲞筮！塑曼！！！塑！！垦翌曼！堕！！竺！：Ｑ！！！！竺！！！！！！！！：！！：盟！：！技术方法．ＰＣＲ—ＲＦＬＰ方法快速鉴别水痘一带状疱疹病毒野病毒与疫苗株周琚龚甜熊英施勇３３００２９南昌，江西省疾病预防控制中心通信作者：周琚Ｅｍａｉｌ：９４３９６４６５＠ｑｑ．ｃｏｎＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ，ｊ．ｉｓｓｎ．１００３—９２７９．２０１６．０５．０１８【摘要】目的ＰＣＲ．ＲＦＬＰ的方法快速鉴别２０１０．２０１５在江西省采集的水痘．带状疱疹标本中的野病毒与疫苗株。方法选取２０１０．２０１５年在江西省南昌市采集的的水痘一带状疱疹感染临床诊断病例的疱疹液和咽拭子标本共１１２份，分别使用特定引物对水痘一带状疱疹病毒（ＶＺＶ）ＯＲＦ６２区、ＯＲＦ３８区和ＯＲＦ５４区进行扩增，对阳性扩增产物分别使用限制性内切酶ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ及ＢｇｌＩ进行酶切，对酶切产物进行片段长度多态性分析。结果１１２份标本中，３９份标本的病毒核酸经特定区域的ＰＣＲ扩增后，对产物进行酶切结果为ＳｍａＩ。、ＰｓｔＩ＋及ＢｇｌＩ＋，而疫苗株酶切的结果为ＳｍａＩ＋、ＰｓｔＩ一及ＢｇｌＩ＋。结论ＰＣＲ—ＲＦＬＰ方法可以快速鉴定ＶＺＶ的野毒株与疫苗株，江西省２０１０—２０１５年采集的水痘・带状疱疹标本中的ＶＺＶ均为野病毒。【主题词】水痘－带状疱疹病毒；野毒株；疫苗株；ＰＣＲ—ＲＦＬＰ基金项目：江西省卫生厅科技计划课题（２０１１２００１）；国家“十一五”科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”（２００９ＺＸｌ０００４—２０７）ＲａｐｉｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｖａｒｉｃｅｌｌａｚｏｓｔｅｒｖｉｒｕｓｗｉｌｄａｎｄｖａｃｃｉｎｅｓｔｒａｉｎｓｂｙＰＣＲ－ＲＦＬＰＴｉａｎ，ＸｉｏｎｇＺｈｏｕＪｕｎ，Ｇｏｎｇｙｉｗ，Ｊｓ＾ｉｙｏｎｇＪｉａｎｇｘｉＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｎａｎｃｈａｎ９３３００２９，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＺｈｏｕＪｕｎ，Ｅｍａｉ｛：９４３９６４６５＠ｑｑ，ｃｏｒｎ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】（ＶＺＶ）ｂｙＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｒａｐｉｄｌｙｉｄｅｎｔｉｆｙｗｉｌｄｓｔｒａｉｎｓａｎｄｖａｃｃｉｎｅｓｔｒａｉｎｓｏｆｖａｒｉｃｅｌｌａｚｏｓｔｅｒｖｉｒｕｓＷｅｈａｖｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄ１１２ｈｅｒｐｅｓｆｌｕｉｄａｎｄＪｉａｎｇｘｉｐｒｏｖｉｎｃｅｉｎ２０１０—２０１５．ＭｅｔｈｏｄｓｔｈｒｏａｔｓｗａｂｓｐｅｃｉｍｅｎｓｆｒｏｍｃｌｉｎｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓｃａｓｅｓｏｆｖａｒｉｃｅｌｌａｚｏｓｔｅｒｉｎＮａｎｃｈａｎｇｆｒｏｍ２０１０ｔｏ２０１５．ＰＣＲ—ＲＦＬＰｉｎｅｘｔｒａｃｔｅｄｖｉｒｕｓＤＮＡｆｒｏｍｔｈｅｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，ｕｓｅｄｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓｏｆＯＲＦ６２，０ＲＦ３８ａｎｄＯＲＦ５４ａｒｅａｓ，ａｎｄｕｓｅｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓＳｍａＩ．ＰｓｔＩａｎｄＢｇｌＩｔｏｄｏｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎａｌｙｓｉｓ．ＲｅｓｕｌｔｓｃａｎＷｅｈａｖｅａｎａｌｙｓｉｓｅｄｒｅｓｕｌｔｓｔｈｅｏｆ３９ｐｏｓｉｔｉｖｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓａｎｄａｌｌｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓＰｓｔｗｉｌｄｂｅｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＳｍａＩ一．ＴｈｅＩ＋ａｎｄＢｇｌＩ＋，ｂｕｔｔｈｅＲＦＬＰｒｅｓｕｌｔｏｆｖａｃｃｉｎｅｉｓＳｍａＩ＋．ＰｓｔＩ—ａｎｄＢｇｌＩ＋．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓｓｔｒａｉｎｓａｎｄｖａｃｃｉｎｅｓｔｒａｉｎｏｆＶＺＶｂｅｔｏｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆＰＣＲ—ＲＦＬＰａｎｄｔｈｅＶＺＶｔｈｅｓｐｅｃｉｍｅｎｓ２０１５ａｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｉｎＪｉａｎｇｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅｆｒｏｍ２０１０ａｌｌｗｉｌｄｓｔｒａｉｎｓ．ｓｔｒａｉｎｓ；Ｖａｃｃｉｎｅｓｔｒａｉｎｓ；ＰＣＲ—ＲＦＬＰＰｒｏｖｉｎｃｅＨｅａｌｔｈ【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ＦｕｎｄＮａｔｉｏｎａｌＡＩＤＳＶａｒｉｃｅｌｌａｚｏｓｔｅｒｖｉｒｕｓ（ＶＺＶ）；ＷｉｌｄＰｌａｎｏｆｐｒｏｇｒａｍｓ：ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｉａｎｇｘｉＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ（２０１１２００１）；ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＭａｊｏｒＰｒｏｊｅｃｔｓｏｆｔｈｅｌｌ”ｆｉｖｅ—ｙｅａｒｐｌａｎｆｏｒＭａｊｏｒＣｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅＤｉｓｅａｓｅｓ．ａｎｄＶｉｒａｌＨｅｐａｔｉｔｉｓＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（２００９ＺＸｌ０００４—２０７）水痘．带状疱疹病毒（ｖａｒｉｃｅｌｌａ—ｚｏｓｔｅｒｖｉｒｕｓ，患水痘和老年带状疱疹后出现遗神经痛的发生率。目前在市场上采用的水痘疫苗均是１９８３年被世界卫生组织推荐的日本的ｖＯｋａ株的减毒活疫苗。但因为水痘疫苗是减毒活疫苗有可能会引起突破感染或是产生疫苗相关病例，因此在广泛使用该疫苗的同时，有必要检测水痘病例或带状疱疹病例中的ＶＺＶ）又被称为人类疱疹病毒３型（ＨＨＶ一３），是临床上常见的水痘和带状疱疹疾病的病原体。Ｔａｋａｈａｓｈｉ等在１９７４年利用水痘病毒野毒株Ｏｋａ（ＯｋａｐＯｋａ）成功研制出水痘减毒活疫苗株（Ｏｋａｐａｒｅｎｔ，ＶａＣｅｉｎｅ．ｖＯｋａ）并广泛用于预防接种…，显著降低了儿童罹万方数据主生塞堕塑堕压堑垂堂苤查！！！！芏！！旦箜ｉ！鲞笙！塑垦！ｉ！！兰！垦！Ｐ垦！ｉ！！！！！！！Ｑ！塑生！！！！！！！！！：ｉ！：盟！：！ＶＺＶ毒株是由疫苗株还是野毒株感染引起。这对水痘疫苗接种效果的评价、疫苗的安全性及质量控制等具有重要意义。１材料与方法１．１（１３７ｂｐ、８５ｂｐ和２５０ｂｐ、１００ｂｐ），而疫苗株则未能被ＰｓｔＩ酶切（见图２）。最后能够进行酶切的３９份标本中的病毒皆为ＢｇｌＩ及ＰｓｔＩ酶切阳性，均为ＶＺＶ病毒野毒株。匾标本来源２０１０—２０１５年在南昌市高新区医院３００２５０２００ｌ５０１００５０及采集的临床诊断为水痘一带状疱疹患者的疱疹液和咽拭子标本共１１２份，标本采集后置于一７０℃冷冻保存。１．２主要试剂与仪器１．２．１试剂ＤＮＡ提取：试剂盒ＱＩＡｍｐＤＮＡＭｉｎｉｋｉｔ（德国Ｑｉａｇｅｎ公司，５１３０６），ＤＮＡ扩增试剂盒ＧｏＴａｑＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司，０００００３１１７１），限制Ｉ、Ｂｇｌ性内切酶ＳｍａＩ及ＰｓｔＩ（ＴａＫａＲａ公司，图１Ｆｉｇ．１部分标本Ｓｍａ１酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果ＡｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＳｍａＩＤ１０８５Ａ，Ｄ１０２０Ａ，Ｄ１０７３Ａ），琼脂糖凝胶（上海生工，ＡＢ００１６Ｈ－２５０Ｇ），ＧＯＬＤＶＩＥＷ染料（Ｓｏｌａｒｂｉｏ，Ｇ８１４０），水痘病毒减毒活疫苗（长春祈健生物制品有限公司，２０１３０１００８）。Ｉ．２．２仪器：ＣＯ，培养箱（美国ＮｕＡｉｒｅ），ＰＣＲ扩增仪ＰＴＣ－２００（美国Ｂｉｏ—Ｒａｄ），凝胶电泳仪（北京六一），全自动凝胶成像仪（ＶｉｌｂｅｒＬｏｕｒｍａｔ）。１．３方法使用ＱＩＡｍｐＤＮＡＭｉｎｉｋｉｔＤＮＡ提取试图２部分标本ＢｇｌＩ及ＰｓＩＩ酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果Ｆｉｇ．２ＡｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＢｇｌＩａｎｄＰｓｔｌ剂盒对原始标本提取病毒核酸，提取过程按照试剂盒说明书操作；使用特异性引物扩增相对应的基因片段，引物序列及对应所用的限制性内切酶。２Ｉ。使用Ｐｒｏｍｅｇａ公司的ＧｏＴａｑＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ试剂对３讨论病毒核酸进行扩增。参考本实验室已建立的限制性内切酶分析方法【３１及参考限制性内切酶试剂说明书进行酶切反应。２ＶＺＶ原发感染表现为水痘，主要的发病人群为儿童，主要以皮肤和黏膜上出现疱疹并且伴有发热为特征；而在水痘症状痊愈后，病毒并不能被机体完全清除，它常在一个或多个脊髓后根神经节或三叉结果神经节中潜伏下来形成潜伏感染。当机体抵抗力降低时，病毒会再被激活并复制，沿神经轴突到达相应神经所支配的胸、腹或面部的皮肤，并在局部细胞内增殖，引发周围神经炎及相应分布区域皮肤的炎症，临床表现为在相应神经支配的皮肤上出现疱疹，并产生神经痛。因病灶主要呈带状分布，故又常被称为带状疱疹”’“。水痘疫苗接种仍后可发生水痘样皮疹，接种的疫苗也可潜伏体内引发出带状疱疹。美国一项调查显示：水痘减毒活疫苗不能提供１００％完全的保护，疫苗接种后数月到数年内，约有５％儿童和１０％成人仍有可能感染ＶＺＶ，一部分是“突破（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ）使用三对引物对原始标本的核酸进行ＰＣＲ扩增，共有３９份标本的产物浓度足够进行酶切实验。对这些产物进行限制性酶切位点分析，发现使用引物ＰＫＶＬ６Ｕ／ＰＫＶＬｌＬ扩增的ＯＲＦ６２区域的产物片段经ＳｍａＩ酶切可均被切分为３个片段（１５３ｂｐ、３６ｂｐ、７９ｂｐ、ｂｐ），而疫苗株则能被切为４个片段（１１２ｂｐ、３６７９ｂｐ、４１ｂｐ），即疫苗株有３个酶切位点（其中１５３ｂｐ片段被切为１１２ｂｐ及４１ｂｐ两个片段）（见图１），而野毒株只有２个酶切位点，即野毒株表现为ＳｍａＩ一、疫苗株为ＳｍａＩ＋；同时，各个标本的特异性扩增产物皆可被ＢｇｌＩ及ＰｓｔＩ酶切为两个片段万方数据生堡塞墅塑！堕压堑至芏苤查！！！！生！！旦箜！！鲞箜！塑垦！ｉ！！！！！曼！￡￡！！！！！！！！！Ｑ！！！！！！！！！！！∑！！：！！：盟！：ｉ感染”，即疫苗没有起到保护的效果而使机体仍然被病毒感染，而另外一部分则是由疫苗株引起的占４０％Ｅ６，７１，是为疫苗相关病例。所以水痘疫苗接种者仍然发生水痘或带状疱疹可能是由野毒株或疫苗株感染所致‘８１。因疫苗株可引起感染导致水痘，不仅如此，它还可与野生毒株一样，潜伏在接种者的感觉神经节中，并能被再次激活而引发带状疱疹。４１，因此在广泛使用减毒活疫苗的同时，也有必要检测水痘或带状疱疹病例感染的ＶＺＶ病毒是否由疫苗株引起。这对水痘疫苗接种效果的评价、疫苗的安全性及质量控制等具有重要意义。限制性片段长度多态性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）的原理是检测ＤＮＡ被限制性内切酶酶切后形成的特定ＤＮＡ片段的大小。凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生的或去除酶切位点）和一段ＤＮＡ的重新组织（如插入或缺失造成酶切位点问长度发生变化）等均可导致ＲＦＬＰ的产生。传统的鉴定ＶＺＶ毒株是否为野毒株基本都是使用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ的方法。一些早期研究发现，在北美和欧洲，绝大多数ＶＺＶ毒株在ＯＲＦ３８中基因组核苷酸中都含ＰｓｔＩ酶切位点（即ＰｓｔＩ＋），而在ＯＲＦ５４中不含ＢｇｌＩ酶切位点（即ＢｇｌＩ一）；而源自日本的疫苗株，因点突变失去了ＰｓｔＩ酶切位点（ＰｓｔＩ一），却形成了一个ＢｇｌＩ酶切位点（即ＢｇｌＩ＋）。因此在早先的研究中，曾提出以ＰｓｔＩ和ＢｇｌＩ双酶切来区分野毒株和疫苗株Ｈ’…１。而Ｌｏｐａｒｅｖ等。２１建立了一种更为简单的方法可以鉴定和区别ＶＺＶ野毒株和减毒疫苗株：通过病毒基因组测序比较发现，疫苗株ｖＯｋａＯＲＦ６２中因点突变增加了一个ＳｍａＩ酶切位点（ＳｍａＩ＋），而野毒株则没有这个位点，故此位点为疫苗株所独有。可以使用ＳｍａＩ对ＯＲＦ６２区域的扩增产物进行酶切，因疫苗株中有３个ＳｍａＩ酶切位点，能被切为４个片段，而野毒株中只有２个，只能被切为３个片段。该方法能准确的将疫苗株和流行于６个洲的野毒株区别开来。本研究收集到的３９份标本中的ＶＺＶ均为ＶＺＶ野毒株，时间横跨２０１０年至２０１５年，这说明江西省一直都有ＶＺＶ的野病毒流行，而我省这些野病毒的酶切结果均为ＳｍａＩ一、ＰｓｔＩ＋及ＢｇｌＩ＋，这与日本本土流行的野毒株ｐＯＫａ株（ＳｍａＩ一、ＰｓｔＩ一及ＢｇｌＩ＋）不一样，与我国李崇山、。…、陈婷婷等”１的报道一致，说明我省乃至我国流行的ＶＺＶ毒株大多数为Ｓｍａ万方数据Ｉ一、ＰｓｔＩ＋及ＢｇｌＩ＋，但甘霖‘１２。等研究发现我国也存在ＰｓｔＩ一的野毒株，说明我国也可能有类似日本本土流行株的野毒株存在，甚至有可能存在与北美欧洲等地流行相同的野毒株，这有待更多的研究来发现。本研究验证了通过ＳｍａＩ酶切的方法可以快速鉴别ＶＺＶ疫苗株与野毒株，与ＰｓｔＩ及ＢｇｌＩ联用更可以鉴别是否有与日本本土的相同的流行野毒株，而不用通过测序的方法来进行鉴别，可以节省较多的时间，使用的仪器设备及试剂耗材也较为简单，利于一些基层实验室或只有基本条件的实验室进行研究，也利于在我国更广泛的开展水痘一带状疱疹的监测工作。●２～一一３４５～～～一６一一一～一７８一～一一一一一９ｍ一～一一一一一¨他一一（收稿１３期：２０１６－０５－１７）一一一～一一４参考文献