高效液相色谱-氢化物-原子荧光联用技术测定海藻中无机砷

吴烨飞;潘友浩;李荣茂

【摘 要】This paper is about the research of the determination of inorganic arsenic in edible seaweeds with High performance liquid chromatography-hydride generation-atomic fluorescence spectrometry ( HPLC-HG-AFS) . The curved surface fitting method was applied to establish optimum conditions of extraction reagent, time and temperature based on the inorganic arsenic contents of Sargassum fusiforme. It was found that the op-timum conditions is with 0. 1%HCL at 52℃ for 78 min. The detection limit of methodology was 0. 0 628 mg/kg. The recovery rates of 1. 0 mg/kg and 10. 0 mg/kg in samples were between 80. 5% and 105. 7%, and the relative standard deviations were between 4. 5% and 5. 0%. The content of inorganic arsenic of sixty types of laver from different areas in Fujian Province was examined. The results showed that inorganic arsenic con-centration in laver was below, which accounted for the total arsenic concentration of 0~1. 96%.%本文采用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光联技术( HPLC-HG-AFS)对海藻中的无机砷进行检测。以藻类中羊栖菜的无机砷含量为指标,确定提取剂的种类和浓度,并通过曲面拟合的方法确定了最佳提取温度和提取时间。结果表明,以1．0%HCL为提取剂,提取温度52℃,提取时间78 min的效果最佳。该方法无机砷的检出限为0．0628 mg/kg,样品加标量为0．2 mg/kg 和1．0 mg/kg 时回收率在80．5%~105．7%之间,相对标准偏差(RSD, n=6)在4．2%~5．3%之间。并应用此分析技术测定了福建省内60个不同产地紫菜样品

中无机砷含量,结果表明,主要生产区紫菜中无机砷含量很低,仅占总砷含量的0~1．96%。

【期刊名称】《福建水产》 【年(卷),期】2014(000)002 【总页数】7页(P125-131)

【关键词】羊栖菜;海藻;无机砷;高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光联用法 【作 者】吴烨飞;潘友浩;李荣茂

【作者单位】福建省海洋环境与渔业资源监测中心，福建 福州350003;福建省海洋环境与渔业资源监测中心，福建 福州350003;福建省海洋环境与渔业资源监测中心，福建 福州350003 【正文语种】中 文 【中图分类】S913

目前国内现行的食品中无机砷检测的国家标准方法包括氢化物原子荧光光度法和银盐法，这也是海藻制品卫生标准中指定的无机砷检测标准方法[1]。一般藻类中总砷含量比较高，但主要以结构复杂的砷糖形式存在，无机砷含量很低，采用此种无机砷检测标准方法对海藻中的无机砷进行检测存在把部分有机砷误测为无机砷的问题[2]，会导致海藻中无机砷含量的误判，影响我国藻类产业的发展。

近几年大部分研究[3-6]多针对藻类中紫菜、海带样品中无机砷的测定，采用酸或有机试剂提取藻类中的无机砷，并应用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光联用技术(HPLC-HG-AFS)或高效液相色谱-电感耦合等离子体联用技术(HPLC-ICP-MS)

等，其中HPLC-HG-AFS联用法是近几年报道最多的一种砷的检测方法。一般海带和紫菜的无机砷含量很低，仅在0.2 mg/kg左右[7]，其中有文献报道[8]，紫菜属海生植物型食品，砷主要以砷糖形式存在，几乎不含无机砷。无机砷含量过低不利于比较不同的前处理方法，藻类的品种不同，也有有机砷和无机砷各占一半左右的情况，在羊栖菜中无机砷含量可达30～130 mg/kg，占总砷含量的50%以上[9]，采用此类样品进行实验可以有效地分析不同提取剂提取效果的优劣，更利于藻类中无机砷检测方法的研究。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

HPLC-HG-AFS联用仪：SA-20原子荧光形态分析装置，配有相同材质填料保护柱(25 mm×23 mm，12～20 μm)的PRP-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)阴离子交换柱(Hamilton，Reno，NV)和AFS-930原子荧光光谱仪，配有激发光源(北京吉天仪器公司)。

砷酸根溶液标准物质(GBW08667)，亚砷酸根溶液标准物质(GBW08666)，一甲基砷溶液标准物质(GBW08668)，二甲基砷溶液标准物质(GBW08669)均来自中国计量科学研究院；甲醇(色谱纯，Merck公司)；盐酸(优级纯，西陇化工)；实验室用水为Milli-Q超纯水(法国密理博)。 1.2 样品处理

取1.000 g羊栖菜干样于50 mL圆底具塞离心管中，加入20 mL 1.0%HCL，摇匀，52℃水浴下恒温震摇78 min，取出后于10 000 r/min下离心5 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤，取0.2 mL上清液，加入0.2 mL双氧水把三价砷氧化为五价砷，用水稀释定容至2.0 mL，摇匀后上机测量，最终通过对五价砷的测量得到样品中无机砷含量。对于其它无机砷含量低的藻类样品，直接取1.8 mL上清液加入0.2 mL双氧水，摇匀后上机测量。双氧水加入量为定容体积的10%。

样品和提取液中总砷的测定依照GB/T5009.11-2003《食品中总砷及无机砷的测定》中氢化物发生-原子荧光光谱(HG-AFS)进行。

表1 无机砷测定的HPLC-HG-AFS条件Tab.1 Experiment condition for determination of inorganic arsenic with HPLC-AFS仪器Instrument项目Item条件Experiment condition高效液相色谱仪HPLC色谱柱ColumnHamilton PRP-X 100(250 mm×4.1 mm,10 μm)保护柱Guard ColumnHamilton PRP-X 100(25 mm×2.3 mm,12～20 μm)等度分离流动相Mobile Phase in Isocratic Separeation15 mmol/L(NH4)2HPO4 pH 6.0进样体积Injection Volume100μL氢化物发生原子荧光光谱仪HG-AFS负高压PMT Voltage250 V灯电流Lamp Current80 mA屏蔽气Shield Gas1 000 mL/min载气 Carrier Gas500 mL/min还原剂Reductant2.5% KBH4+0.5% KOH载流Carrier Solution7% HCL 1.3 标准溶液的配制

混合砷标准储备溶液通过相应的MMA、DMA、As(Ⅲ)和As(Ⅴ)标准物质稀释得到，混合砷标准使用溶液临用时现配，然后再分别配制成20 μg/L、40 μg/L、60 μg/L、80 μg/L、120 μg/L、160 μg/L、200 μg/L的浓度梯度。 1.4 HPLC-HG-AFS条件 本实验的具体条件见表1所示。 1.5 结果计算

样品中无机砷含量计算公式为：ρ=C×V×f/m(mg/kg)，式中ρ为样品中无机砷含量(mg/kg);C为上机时溶液中无机砷浓度(μg/L);V为上机时溶液定容的体积(mL);f为稀释倍数(对于无机砷含量偏低的藻类，f为1.11；对于无机砷含量偏高的样品，f为10)；m为称样量1.000 g。 2 结果与讨论

2.1 提取剂的选择

提取剂是前处理过程中保证高提取率和回收率的前提，也是制约方法准确度的关键因素。目前，海产品中无机砷常用的提取剂主要是低浓度酸、去离子水和有机溶剂[5，10]，本文称取1.000 g羊栖菜干样(粉碎均匀后使用)，采用纯水、甲醇和HCL三种溶液进行提取，比较研究0.5%～60%范围内的盐酸溶液以及0～100%范围内的甲醇溶液在50℃水浴下恒温震摇1 h后无机砷含量。考虑羊栖菜中无机砷含量偏高和色谱柱的耐酸程度，将实验中各浓度梯度的甲醇和在0.5%～20%范围内的盐酸浸提液稀释10倍后上机测定，20%～60%范围内的盐酸稀释30倍后上机测定，无机砷含量结果示于表2。

从表2得知不论浸提液提取率还是无机砷的测量值，不同浓度盐酸的提取效果明显优于水和甲醇溶液的提取效果，这与文献的研究结果相一致[11]。甲醇溶液中无机砷含量随着甲醇浓度的升高而降低，当甲醇浓度达到90%以上时，无机砷含量未检出，说明单纯用有机溶剂提取不能破坏三价砷与带巯基的谷胱甘肽或蛋白质中硫醇之间形成的化学键[12]。本文继续研究了不同浓度的盐酸溶液对无机砷提取量的影响，由图1可知，盐酸浓度在0.5%～60%，无机砷含量变化范围在39.43～43.48 mg/kg之间，当盐酸浓度在1.0%～4.0%时比其它浓度提取的无机砷含量较高，而且通过提取液中的提取率可知，低浓度已能保证将藻类中绝大部分的无机砷浸提。考虑色谱柱的耐酸性，为了减小稀释倍数，利于低浓度样品的检出，因此提取剂的浓度选用浓度较低的1.0%盐酸溶液。

图2是1.0%盐酸溶液提取的无机砷谱图和10%甲醇溶液提取的无机砷谱图，如果存在一种未知有机砷的保留时间与五价砷相重合或保留时间非常接近的情况，将会严重干扰五价砷的测定，而且许多研究[7、13]发现使用酸浸提会使大分子有机砷分解转化，因此在使用酸提取的过程中也许会存在有机砷向无机砷转化的过程，也会造成对五价砷测定的干扰。为了验证用1.0%盐酸溶液不会受大分子有机砷干扰，

分别进行了回收率和对比实验。在羊栖菜中加入DMA和MMA标液，重复酸提取及H2O2氧化的全过程，然后上机测定，结果DMA和MMA的加标回收率均在98.5%～102.0%之间，五价砷的含量没有增加，说明DMA和MMA在酸提取及H2O2氧化过程中不会转化为无机砷，不会对无机砷的测定造成干扰。取1 mL1.0%盐酸浸提液加入1 mL纯盐酸溶液，50℃水浴下恒温震摇1 h，再加入H2O2，稀释后上机测量，提取剂加酸前后的谱图示于图3，1.0%盐酸溶液加酸前后，五价砷峰高无变化，说明在此保留时间无大分子有机砷的干扰。综上所述，选用1.0%盐酸作为提取剂对无机砷的测定无干扰。

表2 羊栖菜样品在不同提取剂、不同浓度下砷的提取率和无机砷含量Tab.2 Extraction efficiency of total arsenic and inorganic arsenic contents with different extractants anddifferent concentration in Sargassum fusiforme 提取剂Extractionreagent浓度/%Content无机砷Inorganic arsenic提取Extraction无机砷含量/(mg/kg)Inorganic arsenic content无机砷含量占样品总砷含量/%Inorganic arsenic accounted for total arsenic in sample提取液中总砷/(mg/kg)Total arsenic in extraction样品中总砷/(mg/kg)Total arsenic in sample提取率/%Extraction

efficiency0.539.6854.154.4173.3074.21.043.0258.764.0273.3087.32.042.5058.061.7373.3084.24.043.4859.362.1573.3084.8盐酸

6.041.3956.562.6373.3085.4HCL10.039.4353.864.1873.3087.612.040.9655.963.7673.3087.020.039.6754.168.6873.3093.740.040.7555.667.1473.3091.660.040.9052.165.9373.3089.9纯水H2O-33.6045.854.6173.3074.510.030.9642.254.2273.3074.020.030.0441.055.6973.3076.030.029.6840.553.3073.3072.740.027.0736.951.0873.3069.7甲醇

50.022.1030.148.3773.3066.0CH3OH60.015.2620.844.1673.3060.270.010.6014.536.4173.3049.780.07.4310.130.8373.3042.190.0ND-21.7973.3029.7100.0ND-5.1973.307.1 注：ND表示未检出。

Note：ND means non-detected.

2.2 提取时间和提取温度的确定

通过曲面拟合的方法找出最佳提取温度和时间，该拟合过程简述为：设定实验数据(xi,yi，zi)(i=1,2,3,…，n)，寻找函数使得在点(xi,yi)(i=1,2,3,…，n)处的函数值与观测数据偏差的平方和最小，同时依据均方根误差RMSE和相关性系数R2来评价该函数模型的效果。实验中温度以10℃为增长梯度从30℃增加至70℃，时间则从15 min到

1 080 min， 其无机砷含量数据示于表3。

通过曲面拟合对无机砷含量与提取温度、提取时间进行拟合，从近千个最高次数小于等于三次的多项式函数中，选取相关性最好、均方根误差最小的曲面函数，其最佳曲面函数如图4所示。经数理统计对该曲面函数求导获得：当提取温度为52.1℃，且提取时间为78.2 min时，无机砷含量值最大。因此本文选择提取温度52℃，提取时间78 min。 2.3 方法检出限、精密度和回收率

方法检出限(MDL)为测量信号是3倍信噪比所对应的被测物浓度。本实验中无机砷的检出限为0.0 628 mg/kg。回收率采用加标回收法，以不含无机砷的紫菜样品为空白样品，分别添加浓度水平为0.2 mg/kg和1.0 mg/kg的五价砷，按照本方法所确定的实验条件，进行标准加入回收实验，对每个浓度水平平行测定6次，无机砷的加标回收率在80.5 %～105.7 %之间，相对标准偏差(RSD)在4.5 %～

5.0 %之间。

表3 羊栖菜在不同温度、不同时间提取时无机砷含量(mg/kg)Tab.3 Effects of extraction temperature and time on inorganic arsenic contents in Sargassum fusiforme温度/℃Temperature时间

/minTime30405060701540.4841.1540.5040.7040.303041.5341.2841.8341.6041.004540.8241.5542.1841.5241.326041.8442.0343.0242.5742.477542.2142.5542.6842.5242.329042.4342.1542.7142.1842.1210542.2342.1542.4142.1842.0212041.7341.7841.8341.6941.7224041.5841.5241.7541.6941.0248041.1540.8841.6841.6440.3672040.7840.7441.5241.3540.231 08040.6840.2341.1941.1540.10

2.4 福建省不同产地的部分紫菜样品中无机砷含量

福建是紫菜养殖大户，本文采用此方法测定了福建省主要紫菜生产区中紫菜的无机砷含量，每个地区随机选取10个样品，检测结果见表4。结果表明，各地紫菜中总砷含量普遍偏高，但是无机砷占的比例很小，仅占总砷含量的0～1.96%，说明紫菜中98%左右的砷以无毒砷的形式存在。

表4 福建省主要紫菜生产区紫菜中无机砷及总砷含量调查结果Tab.4 The contents of inorganic arsenic in laver from different regions in Fujian地区Area样品名称Sample无机砷/(mg/kg)Inorganic arsenic总砷/(mg/kg)Total arsenic福鼎Fuding干紫菜Dry laverND～0.5827.16～31.40霞浦Xiapu干紫菜Dry laverND～0.2225.45～28.94连江Lianjiang干紫菜Dry laverND～0.5926.59～30.16莆田Putian干紫菜 Dry laverND～0.5424.56～29.25.厦门Xiamen干紫菜Dry laverND～0.5325.85～30.89漳浦Zhangpu干紫菜Dry laverND～0.3222.56～27.92

注：ND表示未检出。

Note：ND means non-detected. 3 小结

(1)本实验建立了一种新的测定藻类中无机砷含量的方法：1.0%HCL为提取剂，提取温度52℃，提取78 min，之后用双氧水氧化，高效液相色谱-氢化物发生原子荧光(HPLC-HG-AFS)测定，检出限为：0.0 628 mg/kg。

(2)用此分析技术测定了福建省内60个不同产地紫菜样品中无机砷含量，结果表明：主要生产区紫菜中无机砷含量很低，仅占总砷含量的0～1.96%。 参考文献：

[1]中华人民共和国卫生部.GB19643-2005藻类制品卫生标准[S].北京：中国标准出版社，2005.

[2]韦昌金，刘丽萍，刘霁欣，等.无机砷分析方法的探讨[J].现代科学仪器，2006，16(6)：63-65.

[3]刘桂华，汪 丽.HPLC-ICP-MS在紫菜中砷形态分析的应用[J].分析测试学报，2002，21(4)：88-93.

[4]郭莹莹.海藻中砷化合物检测技术研究及食用安全性评价[D].青岛：中国海洋大学，2008.

[5]尚德荣，宁劲松，赵艳芳，等.高效液相色谱-氢化物发生原子荧光(HPLC-HG-AFS)联用技术检测海藻食品中无机砷[J].水产学报，2010，34(1)：132-138. [6]陈少波，余雯静，赵玉兰.食品中砷形态分析及无机砷测定[J].农产品加工，2013，314(4)：80-86.

[7]吴成业，钱卓真，吴抒怀，等.紫菜中无机砷含量的分析研究[J].福建水产，2010，124(1)：29-32.

[8]尚德荣，赵艳芳，郭莹莹，等.食品中砷及砷化合物的食用安全性评价[J].中国渔

业质量与标准，2012，2(4)：21-32.

[9]Gamble B M， Gallagher P A， Shoemaker J A， et al. An investigation of the chemical stability of arsenosugars in simulated gastric juice and acidic environments using IC-ICP-MS and IC-ESI-MS and IC-ESI-MS/MS[J].Analyst，2002，127：781-785.

[10]李卫华，刘玉海.高效色谱-电感耦合等离子体质谱法分析海藻类海产品中砷的形态[J].分析试验室，2012，31(8)：74-78.

[11]Milstein L S， Essader A， Murrell C. Sample Preparation， Extraction Efficiency， and Determination of Six Arsenic Species Present in Food Composites[J]. Food Chem.，2003，51(15)：4180-4184.

[12]Alberti J， Rubio R， Rauret G. Extraction method for arsenic speciation in marine organisms[J]. Anal. Chem.， 1995， 351： 415-419. [13]高继庆，林 洪，张秀珍，等.原子荧光光谱法检测海藻中无机砷含量[J]．分析试验室，2008，5(27)：111-114．