细胞免疫荧光操作要点

接种到24孔板中，置5％C02培养箱培养1天，待细胞接近长成单 层，取出孔板，4％多聚甲醛37℃，固定30min，含1％Triton X-l00的PBS溶液37℃作用30min增加细胞膜的通透性，非免疫动物血清37℃封闭40分钟，吸净血清后分孔做好标记加入抗体 （1：100），4℃湿盒过夜，次日预冷的PBS溶液冲洗5分钟×3次后避光加入分别相应的荧光标记二抗(1：50)，加入异硫氰酸荧光素 （fluoresceinisothiocyanate，FITC）（绿色）标记的二抗（1：50）置湿盒内，避光37℃，孵育30分钟，PBS冲洗5分 钟×3次后，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（1：1000）避光37℃复染 细胞核20分钟。PBS冲洗5分钟×3次后，使用倒置荧光显微镜（TE2000，NIKON）观察成像。阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤同实验组相 同。

1％Triton X-l00所起的作用应该是溶解膜上的脂质分子，从而增加膜的通透性，使抗体容易进入细胞。一般30min足以，如果是核内蛋白，可以适当增加时间。

目的蛋白是NFKBp65，检测它在乳腺癌MDAMB231细胞里的核转位情况，我用的一抗二抗都是CST的，我用的步骤是

1 甲醇-20度固定5分钟（建议用4％多聚甲醛固定，使用多聚甲醛前（因为一般配好的多聚甲醛都放在4度冰箱内避光保存）平衡至室温再用，否则细胞会遇冷收缩，形态发生改变。不需要透膜。）

2 pbs-0.2﹪triton漂洗3次，pbs-1﹪triton破膜15分钟，然后再洗三次洗涤液同上 3 5﹪BSA封闭1h

4 一抗1:100 4度孵育了近20小时，然后洗三次 5 二抗1:150避光室温1h

免疫荧光第一步的步骤几注意事项

1.首先是玻片的处理:泡酸去污, 冲洗, 晾干, 泡纯酒精脱脂, 蒸馏水洗(此时要用镊子夹着洗), 晾干备用.

2.不知道你做的细胞是贴壁比较好的细胞比如干细胞,还是贴壁不大好的细胞比如神经元 前者的话可以不用多聚赖氨酸包被玻片,后者爬片之前要包被多聚赖氨酸以免洗片时细胞掉片

3. 固定,我用的是预冷纯丙酮固定15分钟(应为丙酮有毒,操作的时候小心些),这步应该注意:丙酮很容易挥发,但又要保证固定期间不能干片,所以要多滴加丙酮,其间用盖子盖住,这一步不要在6孔板内进行,因为丙酮会将其熔化. 4. 不知道你的一抗是 在胞浆表达还是在胞核表达

如果在胞浆表达,可以不用0.01%的TRITON X-100渗透(我前几次用了TRITON,结果胞核也表现出很强的荧光), 当然,如果一抗是在胞核内表达要用TRITON 渗透15分钟 5. 5%的正常山羊血清或是5%的BSA封闭,注意这一步不要洗,只是甩掉多余的封闭液. 6. 加一抗,根据你所做抗体的需求稀释,一般是先将稀释液加到EP管里,后加一抗.(一抗在吸出来之前要离心10-20秒),一抗的量要多加些,也是为了避免干片.

7. 孵育抗体:最好是4度冰箱过夜,这个过夜不是简单的过夜,一般要达14-16个小时,此时要将6孔板做成湿盒,目的是妨干片.在孵育期间不要随意搬动,以免抗体流失. 注意,PBS液的PH值要调在7.4左右

免疫荧光第二步的步骤及注意事项

1. 等抗体孵育过后,取出洗片,这是要注意不要把不同抗体的片子混在一块了(比如冲洗玻片的吸头要一对一,冲完一种抗体后要去掉,换另一个再冲)

2. 洗后自然晾干,加荧光二抗(一般这也要摸个浓度,并不能按部就班地照着说明书上稀释),室温孵育45-60分钟,注意要避光,虽说荧光除非再紫外灯下才会淬灭的快,但操作时还是要注意避光

3. PBS洗,洗的时候还是要注意避光

4. 洗后自然晾干,加第二种荧光探针(我做的是一抗在胞浆表达,加第二种荧光谈针是染核,这样便于计数)孵育10-15分钟,避光条件下作用,洗片时也要避光. 5. 自然晾干后,50%缓冲甘油封片.

特别需要注意的事项再补充一下： 1，接种细胞密度很重要。不要过密或者过稀，这点很重要，直接决定你实验结果的好坏； 2，关于固定问题，使用4%的多聚甲醛，效果还是不错的，固定一般室温，时间10分钟就足够了； 3，清洗是个关键步骤。免疫染色涉及好多清晰的步骤，因此在清洗的时候一定要小心谨慎，防止细胞被冲掉或挤到一起的现象发生； 4，加荧光标记的二抗时一定要注意避光，防止荧光淬灭。而且在荧光显微镜观察的时候也要注意防止光线过强。

常见问题分析：

背景强，有可能 1、玻片是否处理得当；2、洗片没洗干净；3、洗片用的PBS很脏；4、抗体用前没有稍离心，离心过后取上清进行稀释；5、用的荧光二抗浓度太高，并不是说坑体浓度高就会增强荧光，相反，会增加背景染色。还有就是二抗得质量问题。

抗 体淬灭得太快有可能 1、操作过程中未避光（可能性不是很大），2、二抗稀释不当（太稀了），3、 二抗质量存在问题，SIGMA公司（博士得公司分装)的Cy3，荧光很强，做出的图片很漂亮。