细胞生物学实验7-染色体制备技术

实验7 染色体制备技术

〔实验目的〕

1、 学习染色体标本的制备技术

2、 掌握滴片法制备染色体标本的一般步骤

〔实验原理〕

每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大小的染色体，在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在中期，此时染色体形态最典型，然后通过低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜下呈现出其形态。

〔试剂材料〕

1、 试剂

（1） 0.1%秋水仙素溶液（生理盐水配置）

（2） 1mol/L盐酸

（3） 1%柠檬酸钠溶液

（4） 0.067mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）

Na2HPO4﹒12H2O 11.81g

(Na2HPO4﹒2H2O 5.92g)

KH2PO4 4.5g

蒸馏水至1L

（5） Giemsa原液（pH6.8）（pH6.8）Giemsa染粉1g，甘油 33ml, 甲醇 45ml

染粉在乳钵中滴加少许甘油研磨至无颗粒，再将全部甘油加入，放入60-65℃保温2小时后加入甲醇混匀。棕色瓶中保存。用时和磷酸缓冲液1：10混合

（6）低渗液：0.4%KCl

2、 材料

（1） 洋葱根尖

（2） 女性口腔上皮

（3） 蟾蜍

〔内容方法〕

X染色体标本制片与观察

1、 取材：女性漱口后取口腔上皮细胞，涂在干净的载玻片上

2、 固定：95%乙醇固定10分钟，空气干燥

3、 水解：1mol/L盐酸室温水解10分钟，然后用新鲜蒸馏水冲洗4次，晾干

4、 染色：Giemsa染色10分钟，蒸馏水冲后90%乙醇分色1分钟，酒精灯过火脱水。也可用0.2%甲苯安蓝染色5-15分钟，冲洗后干燥，观察

注意事项：

1、 女性口腔、牙签和载波片要干净，避免杂质干扰。

2、 口腔内第一次获取的上皮细胞要弃去，然后在相同部位再获取新鲜的上皮细胞。

3、 上皮细胞涂片时尽量使细胞分散开，重叠的细胞影响观察。

4、 人的X小体紧贴细胞核膜内侧，但是一般上皮细胞中只有30%-50%的细胞可以观察到X小体。

小鼠骨髓染色体制备

1、小鼠按照4μg/g体重经腹腔注射秋水仙素，3-4小时后杀死动物，取后肢股骨和胫骨，纱布剥离所有肌肉，生理盐水洗净后剪去骨两端。

2、注射器针头吸取2%柠檬酸钠溶液或生理盐水注射入骨髓腔，把骨髓细胞冲出来。

3、用针管反复吹吸，使分散成为单个细胞。

4、骨髓细胞溶液离心1000r/min5分钟，沉淀细胞，去上清。

5、用预热至37±0.5℃的0.4%KCl 4ml低渗处理15min, 37±0.5℃。

6、1000r/min5分钟，沉淀细胞，去上清。

7、预固定：加入固定液甲醇：冰醋酸（3：1）4ml，（注意不要冲动细胞团块）静置20分钟,然后1000r/min离心4分钟，去上清。

8、固定：沉淀细胞加入固定液甲醇：冰醋酸（3：1）4ml固定20分钟。

9、滴片：固定后细胞根据多寡加入新鲜配置的固定液，在湿、冷、干净的玻片上方45cm处滴片，3滴左右，不重叠，滴片后迅速吹口气使细胞分散，在酒精灯上过火几次，晾干。

10、Giemsa染色10分钟，后冲洗数秒（不要把染料倾去，直接流水冲洗），晾干后观察。

注意事项：

1、 秋水仙素浓度和作用时间：浓度过高、作用时间过长会使染色体过分收缩而不利于形态观察。

2、 离心转速：转速过高细胞会结团，不利于染色体伸展，一般1000r/min为宜。

3、 低渗处理是实验成败关键。低渗目的是使细胞体积膨大，染色体松散，低渗处理时间

过长会使细胞破裂，染色体丢失；时间过短染色体聚集在一起，不能伸展。细胞可用蒸馏水37℃处理20分钟或预热37℃的0.075M KCl处理15分钟；组织块低渗要延长时间。

4、 固定液要现配现用。

核仁组织区染色

1、秋水仙素处理的染色体

制备的新鲜染色体可以直接滴加等量50%硝酸银、2%明胶显影液，盖上搽镜纸，在70℃电热板上保温数分钟，颜色转为黄色时用水冲洗。

2、小鼠腹水细胞作样品

（1） 小鼠腹水少许，涂片

（2） 固定：甲醇中固定10min，晾干

（3） 染色：1-2滴2%明胶显影液，再滴2-4滴50%硝酸银，混匀

（4） 盖上搽镜纸，在70℃电热板上保温数分钟，颜色转为黄色时用水冲洗。

（5） 镜检：高倍镜下可见细胞核黄色，核仁黑色。

〔注意事项〕

1、 样品新鲜

2、 载波片清洁、无尘、无细胞碎片，避免干扰

3、 腹水细胞涂片注意细胞不要重叠

作业

绘制观察到的染色体