2。3.1。4 MBP-Permatin蛋白中半胱氨酸残基及二硫键数目的测定
L半胱氨酸可于5,5—二巯基双-2硝基甲苯（DTNB)发生硫醇-二硫化物交换反应,在碱性条件下反应显黄色,在412 nm处有强烈吸收峰.该反应可特异地检测—SH，从而定量检测L半胱氨酸含量.
分析MBP标签氨基酸序列可知,该标签蛋白中不含有半胱氨酸，故不影响原核表达的Permatin中半胱氨酸残基的数目。采用DTNB方法测定样品的巯基数,其方法的主要步骤为： 1）样品先用8 M尿素37℃处理4 h；
2）游离巯基数的测定: 向未经尿素处理的1。0 ml样品（0。38 mg/ml）中加入2ml Tris—Gly(0。086 M Tris， 0。09 M Gly, pH 8。0），加入50μl DTNB(10 mM DTNB, 200 mM Tris-HCl， pH 8。0),5 min后测定412nm处的吸光值； 3） 总的巯基数的测定： 向经尿素处理的0.5ml样品中加入2ml Tris—Gly,加入50μl β—巯基乙醇（β—ME），37℃温浴1h，加入10 ml 12%三氯乙酸(TCA）,37℃温浴1 h,11000 rpm离心30min，用5ml 12% TCA重悬沉淀两次，以彻底去除β—ME，最后用2ml Tris—Gly重溶沉淀，加入50μl DTNB溶液，5 min后测定412nm处的吸光值。
利用公式：μmol SH/g=73。53×A412×D/C进行计算.其中A412是412 nm处的吸光值， D为稀释倍数，C为蛋白浓度, 73.53是一个系数，由106/1。36 x 104得到。
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