一种鸡蛋白蛋白多肽的制备方法[发明专利]

*CN101712974A*

(10)申请公布号 CN 101712974 A(43)申请公布日 2010.05.26

(12)发明专利申请

(21)申请号 200810121543.3(22)申请日 2008.10.07

(71)申请人湖州来色生物基因工程有限公司

地址313100 浙江省德清县武康镇长虹街

333号申请人吴菁(72)发明人陈群 吴菁(51)Int.Cl.

C12P 21/06(2006.01)C12N 9/50(2006.01)C07K 1/30(2006.01)C07K 14/77(2006.01)

权利要求书 1 页 说明书 3 页

(54)发明名称

一种鸡蛋白蛋白多肽的制备方法(57)摘要

本发明公开了一种鸡蛋白蛋白多肽的制备方法。取鸡蛋蛋清，边搅拌加入有机溶剂沉淀剂，后静置离心，上清液再加入2倍体积的冷丙酮，充分搅拌离心。合并两次所得到的沉淀物，即为卵清蛋白粗品。将沉淀物加入蒸馏水，调至pH4.5－5.0，常温浸泡1-2小时，抽滤，加蒸馏水使蛋白质浓度为5％，加入复合酶，用微波进行间歇式加热处理5min，然后灭酶。灭酶后的酶解液过滤浓缩，真空干燥，得到的产品即为鸡蛋白蛋白多肽产品。

CN 101712974 ACN 101712974 A

权 利 要 求 书

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1.一种鸡蛋白蛋白多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：取鲜鸡蛋，去壳取其蛋清，边搅拌边缓慢加入等体积的有机溶剂沉淀剂，搅拌30min后4℃静置1-4h，离心，将得到的上清液4℃下加入两倍体积的冷丙酮，充分搅拌，离心。合并两次离心所得到的沉淀物，该沉淀物即为卵清蛋白粗品。而后将沉淀物按照1∶4加入蒸馏水，调至pH4.5-5.0，在常温下浸泡1-2小时，每15min搅拌一次，后抽滤，再加蒸馏水使蛋白质浓度为5％，加入复合酶7000(U/g蛋白)，用微波进行间歇式加热处理，温度为45℃，PH4.5-5.0，处理时间为5min。然后升温至80℃，10min灭酶。再将灭酶后的酶解液用硅藻土过滤浓缩，真空干燥，得到的产品即为鸡蛋白蛋白多肽产品。

2.根据权利要求1所述的有机溶剂沉淀剂，其特征在于所说的：0.5mol/L三氯醋酸——丙酮(1∶2，V/V)或乙醇——丙酮(1∶1，V/V)。

3.复合酶，其特征在于：中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶∶菠萝蛋白酶＝1∶2∶4，温度为45℃，PH4.5-5.0；或者木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶∶碱性蛋白酶＝2∶1∶2，温度55℃，PH5.5-6.5。

4.根据权利1所述的得到的最终产品鸡蛋白蛋白多肽，其特征在于该产品是白蛋白多肽分子的混合物。

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CN 101712974 A

说 明 书

一种鸡蛋白蛋白多肽的制备方法

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技术领域

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本发明是关于一种鸡蛋白蛋白多肽的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

白蛋白又称清蛋白，是血浆中含量最多的蛋白质，占总蛋白的55％，相对分子质量

较小。白蛋白多肽是人体血浆中的一种功能大分子蛋白质，是维持血浆渗透压、增加血容量，提供平衡氨基酸的重要成分，是人体不可或缺的营养物质。[0003] 卵清蛋白是鸡蛋中主要的蛋白质，占干重的85％。鸡卵清白蛋白和人血清白蛋白的氨基酸组成比例非常相似，具有全部的20种氨基酸，是目前最优秀的蛋白质，可代替白蛋白进行一系列的生理活动。其一级结构由385个氨基酸组成，分子量为42699Da，含有四个半胱氨酸和一个胱氨酸二硫键构成的球状糖蛋白质，C端的序列为Lys-Val-Ser-Pro-COOH，N端的甘氨酸(Gly)为乙酰化修饰，等电点为4.5，PAGE电泳图谱分析有3个条带，由于含有人体必需的平衡氨基酸，其生物效价高达94％。另一方面，卵清蛋白的多肽链中含有一些特殊的肽质，选择适宜的蛋白水解酶可以得到一些具有特异生理调节功能的生物活性肽。再次，鸡蛋是人们生活中常食用的一种食物，它来源广泛、价廉物美。如能对其进行深加工，则大大提升了鸡蛋的实用价值。[0004] 经研究已证实，作为功能性活性肽，白蛋白多肽具有良好的生物学性能，对人体的保健方面将发挥巨大的作用，其生物活性主要表现在以下几方面：1、易消化和吸收，促进免疫组织的功能恢复，恢复胸腺、脾、淋巴等功能，增强免疫力2、调整肠道菌群，提高食物转化率3、具有促进核苷吸收及运转的作用，并增加在肝和胸腺组织的分布，促进钙、铁、核酸等物质的吸收4、改善低蛋白血症，促进病后手术康复、提供小肽营养，保湿、护肤和美容。5.它在体内产生生物学效应时，并不会引起过敏反应，对于婴幼儿、中老年人、孕妇病后恢复及肠胃功能障碍患者具有显著的应用价值。[0005] 现在，对白蛋白的研究也越来越多，人们不断的寻找更加经济实用的方法来开发白蛋白系列产品。经研究证实，将白蛋白进一步水解得到多肽产品，更有利于吸收，并且在对人的保健方面将发挥更大的作用。

[0006] 目前水解白蛋白常用化学降解法和酶降解法。化学降解法条件剧烈，蛋白质营养损失大，因而现已较少采用。而酶降解法在温和条件下，可通过定位水解产生特定的肽，且安全可靠，无副作用，因此白蛋白的定向酶解技术已成为国内外研究的热点。现在已有的研究多数是采用单一的酶用于水解蛋白质得到多肽或者氨基酸产品。单一的酶常常存在作用不全面的特点且作用时间较长。由于蛋白质易变性，对反应温度要求较苛刻，单一的酶解大多需要6h以上。这样对产品的性质造成了不良的影响。我们采用微波加热结合复合酶水解方法，不但增加了蛋白质催化位点，克服了单一酶作用不全面的缺点，而且反应条件温和，大大缩短了反应时间，能快速而有效地将白蛋白分解成分子量低的多肽。

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说 明 书

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发明内容

本发明的目的之一是提供一种鸡蛋白蛋白多肽的制备方法。

[0008] 本发明的目的之二是提供对白蛋白多肽的生理调节功能和生物学活性说明。[0009] 本发明所说的白蛋白多肽是一种以鲜鸡蛋为原料，分为两个步骤：首先是将鲜鸡蛋卵清进行处理得到卵清蛋白，再采用复合酶法结合微波法水解卵清蛋白，得到白蛋白多肽产品。

[0010] 本发明解决的技术方案如下：[0011] 取鲜鸡蛋，去壳取其蛋清，边搅拌边缓慢加入等体积的有机溶剂沉淀剂，搅拌30min后4℃静置1-4h，离心，将得到的上清液4℃下加入两倍体积的冷丙酮，充分搅拌，离心。合并两次离心所得到的沉淀物，该沉淀物即为卵清蛋白粗品。而后将沉淀物按照1∶4加入蒸馏水，调至pH4.5-5.0，在常温下浸泡1-2小时，每15min搅拌一次，后抽滤，再加蒸馏水使蛋白质浓度为5％，加入复合酶，用微波进行间歇式加热处理，温度为45℃，PH4.5-5.0，处理时间为5min。然后升温至80℃，10min灭酶。再将灭酶后的酶解液用硅藻土过滤浓缩，真空干燥，得到的产品即为鸡蛋白蛋白多肽产品。[0012] 本发明采用以复合酶水解卵清蛋白，增加了蛋白质催化位点，克服了单一酶作用不全面的缺点，有效地将白蛋白分解成分子量低的多肽。该反应条件温和，将复合酶法和微波技术相结合，不仅缩短了反应时间，而且还具有以下优异之处：1、原材料鸡蛋材料来源广泛，是人们日常生活中很常见的食物。2.复合酶解法不减少鸡蛋的营养价值，可获得比鸡蛋蛋白质多的功能。2、酶解得到的多肽可保持营养纯天然绿色属性，不含任何化学物质，没有任何苦味和异味。3、酶解出的多肽不会引起过敏，可增加原蛋白质没有的重要的生物学功能和营养特性。4、酶解法可有效的控制多肽的分子量段。5.微波法是一种先进的方法，它操作简单，温控性能好，反应时间短，产品的得率高。[0013] 白蛋白多肽的生理学功能

[0014] 白蛋白多肽作为一种生物活性肽，它在对人体的生理调节方面具有其独特之处：1.白蛋白多肽能平衡地调节机体免疫功能。白蛋白多肽片断序列中Ala-His、Val-His和Val-His-Ala-Asp-Glu-Asu中组氨酸序列能抑制自由基对脂质体(liposomas)磷脂酰胆碱的过氧化，保护免疫细胞膜，降低细胞过氧化物含量或消除免疫反应途径中生成的过量自由基而影响机体的免疫功能。食物中添加多肽类的物质，通过提高细胞免疫功能，增强巨噬细胞、自然杀伤细胞等吞噬或杀伤病毒、细菌的能，可提高机体抵抗传染性疾病的功能。食用白蛋白多肽与核酸可促进核苷酸的吸收利用，有益于免疫细胞内核酸代谢的补求合成，对动物机体细胞免疫具有增强作用。2.可抑制血管紧张素转换酶(ACE)卵清蛋白经胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解后，得到几个序列的生物活性肽，其可以通过调节RAAS体系控制高血压，对降血压剂的发展起着十分重要的作用。3.捕获自由基抗氧化应激、抗衰老。自由基是人体新陈代谢过程中的产物，随着年龄的增大及不利的内外环境(如辐射、吸烟、环境污染、精神压力等)的影响，自由基的数量出现激增，过多的自由基攻击细胞膜中的不饱和脂肪酸，在脂质过氧化的链式支链反应中不断的生成脂质自由基，细胞功能日渐退化而衰退、损伤和病变，所以，过量的自由基的毒性反应是造成人体衰老和大部分疾病的直接原因。目前已通过体外清除自由基DPPH(2，2联1——三硝基苯肼)的实验表明，白蛋白多肽具有清除自由基抗氧化应激作用，其由5～16个氨基酸构成的肽链中主要含有芳香族的氨基酸，

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说 明 书

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如缬氨酸、亮氨酸、N末端的脯氨酸、组氨酸、酪氨酸等氨基酸组成。白蛋白多肽捕获自由基抗氧化应激的机制为：a.肽链中N一末端的Asp～Arg-Val-Tyr的序列为His残基提供一个氢原子给自由基提供_『条件，His本身还原为2一异咪唑衍生物，因此Asp-Arg-Val-Tyr序列对抗氧化活性是十分重要的。b.咪唑环对金属离子的螯合作用，使金属离子(Fe、Cu“)催化自由基链式反应的活性失活，减少自由基的生成。c.组氨酸系列能抑制自由基对脂质体(liposomes)磷脂酰胆碱的氧化，保护细胞膜的正常功能。4.调节胃肠道功能。胃肠道是人类营养物质的消化吸收的器官，对人体的健康十分重要。人体肠道中存在大量属于正常菌群的微生物，机体免疫功能正常时，各种菌种相互抑制、拮抗，维持肠道内的微生态平衡，但在一些病理的状态下(如胃肠炎、肠梗阻、外科手术等)，消化道缺少食物的有效刺激，营养素的供给不足导致肠粘膜萎缩，肠道功能及屏障受损。还可导致肠道菌群失调，生理性的厌氧数量下降，条件致病菌异常增殖。有学者报道，谷氨酰胺(Gln)有利于维持小肠粘膜的结构、代谢和功能的稳定，改善肠粘膜屏障的作用已广泛应用于临床。这是由于谷氨酸和谷氨酰胺二种氨基酸在氮的代谢中以及在氨基酸的氧化代谢中发挥着至关重要的作用，白蛋白多肽对于调整肠道菌群、促进超短肠综合症的康复以及提高消化食品的转化率、促进铁的吸收均有明显功效，这是由于白蛋白多肽富含谷氨酸和谷氨酰胺，其含量高达18％左右，而且能为益生菌提供必需的氨基酸和肽链，因此白蛋白多肽能维护肠道菌群、促进双歧杆菌的增殖，从而调节胃肠功能，对于具有消化道疾病及年老体弱的人群具有良好的营养支持和辅助治疗作用。

[0015] 白蛋白多肽是从卵清蛋白通过酶工程得到的天然的产品，无毒，可长期服用，不但具有鸡蛋的营养价值，提供机体必需的氨基酸和供能，同时还拥有调节免疫、抑制ACE活性及抗氧化、抗衰老、调节胃肠道菌群等多方面的生理调节功能，在开发营养性功能性食品方面具有广阔的应用前景。

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