甜米酒酒曲微生物分离和菌种鉴定

品化学与 科技学 310023；2.浙江省农业生化 同 中 310023)摘要:甜米酒传统酿制工艺中对微生物多样性的研究较为不足。对不同来源的酒曲微生物进行分离和初步分类鉴

定。从12种甜米酒酒曲分离纯化细菌和真菌微生物，分别利用细菌16SrRNA基因和真菌内部转录间隔区(internal

transcribed spacer,ITS)序列为目的基因进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增和测序，通过序列相 似性比对和构建系统发育树，并分别进行细菌和真菌初步菌种鉴定。结果显示，从12种不同来源的酒曲筛选和分离

到46株细菌和54株真菌；通过分子生物学方法鉴定出41株细菌和16株真菌的种属；酒曲微生物中含有大量芽孑包

杆菌(Bacillus),少量病原菌和腐败菌，表明酒曲仍需要严格的制作工艺和标准；真菌除酿酒酵母外，还鉴定出毕赤酵

母和扣囊复膜酵母等非酿酒酵母及米根霉、小胞根霉、印度毛霉和卷枝毛霉等丝状真菌9

关键词：甜米酒；酒曲；分离鉴定；芽胞杆菌；生物多样性Isolation and Identification of Fungal and Bacterial Strains from Chinese Sweet Rice Wine Starters

CAI Hai-ying1^, ZHANGTing12, SHENLing-zhi12, PENGPei-ying1^, DAIJing12, ZHANG Qi1'2,

LUOJie12, MAO Ke-yu1^, CAI Cheng-gang1^, MAO Jian-wei1,2,c(1. Zhejiang Key Lab Nor Chem & Bio Processing Technology of Farm Product, Zhejiang University of Science &Technology,Hangzhou 310023, Zhejiang, China; 2. Zhejiang Provincial Collaborative Innovation Center of Agricultural Biological Resources Biochemical Manufacturing Hangzhou 310023 Zhejiang China Abstract: Research on microbial diversity in traditional fermentation technology of sweet rice wine was

inadequate. The microbes from different Jiuqu starters were isolated and primaryly identified for species in this基金项目:浙江省自然科学竝一般项目(LY18C200006)作者简介:蔡海莺(19>2—),男(汉)，讲师,博士,研究方向:功能性食品成分、酶制剂和发酵生物技术。 *通信作者:毛建卫(1964—),男(汉)，教授，研究方向:生物资源提取与应用和发酵生物技术等。及抗噬菌体菌株的筛选[J/OL].食品科学：1-12[2019-02-09].http： //kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20180702.1620.024.html[14] 王慕华，潘佩平,赵玉明，等.嗜热链球菌抗噬菌体菌株的选育

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生物工程蔡海莺，等：甜米酒酒4微生物分离和菌种鉴定target gene, respectively. The sequence alignments were used to construct the phylogenetic tree based on the sequence homologies, and primaryly identify the bactorial and fungal species of the microbes isolated, respectively. The result showed that 46 bacterial strains and 54 fungal strains were isolated from 12 Jiuqu

samples, among which 41 bacterial strains and 16 fungal strains were successfully identified for genus

classification. The results of species identification showed that Bacillus was the dominating genera and a few species of pathogenic and spoilage bacteria were detected in the samples, indicating the necessity of

establishing a stricter producing technique and standard for Jiuqu of sweet rice wine. For the fungal strains in the Jiuqu samples, besides the typical ethanol -producing yeast Saccharom-ces cerevisiae, non -Saccharom-ces

-easts like Pichia kudriavzevii and Saccharom-copsis fibuligera and filamentous fungi including Rhizopus

or-zae , R. microsporus , Mucor circinelloides and M. indicus were found.Key words: Chinese sweet rice wine; Jiuqu starter; isolation and identification; Bacillus # microbial diversity

引文格式：

蔡海莺，张婷，沈灵智，等.甜米酒酒曲微生物分离和菌种鉴定[几食品研究与开发,2019,40(24):204-210

CAI Haiying, ZHANG Ting, SHEN Lingzhi, et al. Isolation and Identification of Fungal and Bacterial Strains from Chinese

Sweet Rice Wine Starters[J]. Food Research and Development, 2019,40( 24 ) ： 204-210甜米酒是我国的传统酒种，历史悠久，主要以优 发展， 酒 微生物在传统米酒的发酵过 微生物

质糯米为原料，在自然环境中通过微生物混合发酵而 成。米酒柔和绵长，香气宜人，是我国百姓饮食文化中

功的认识有了长足的步，包括酵母酒化、酵母生 香、根霉的化 红霉增强酯化 以厌氧

必不可少的部分。我国南方大米产区素有在家酿造独 异养己 乳 的米酒风味形成作用等［7-9］,特风味米酒的传统［1］。另外，米酒的营养价值同样引人 关注，除原料自身营养成分外，还包 米酒传统酿制

均表明酒曲微生物米酒风味和风的形成以米 酒的功 营养有 要 。然而，人们 甜米酒酒

过 中产生的 米酒 体 大，

生素曲微生物的分离鉴和样的研究仍然少。本研究鉴于甜米酒酒曲微生物米酒发酵过程、

人体消化吸收成分叫甜米酒虽然功效，但国内甜

产质 ，习。米酒6000 以前1700原料 气 和功 风味和生物 的潜在 ，通过收集少，产和

。酒

同的酒曲样， 细 和真 微生物的分

离、形态学观察和分子生物学鉴，酒微生物的酿制为 种微生物混合自然发酵的过，酒 为发 酵过中微生物的主要

样分析，为甜米酒酿提供了生物资的选择 依据和参考，同 有

的中国， 的文 可 揭示米酒微生物的 机的 要 ［)］。和提高米酒的品质

义。方面具有要理论和我国传统酒 的

环境微生物 种 素的 ，酒。微生物种可发酵的 ，酒中微生物多 样性和

以微生物

1材料与方法1.1材料与试剂酒分别 1.2

孝感、苏州、丽水、南宁、黔东、达州、米酒 的质风味和营养功 有 要 ［4+5。

发酵，

的酒 味， 为 自然的发酵米酒 质和风 种 和 质 的微生物

阜阳、岳阳和绍兴地，编号表1。化 以 ，同 风嘔此，获得

种还可 食 的与SW-CJ-2FD

苏州 气 有和 高甜米酒酒是发展公司:DHG-9240A鼓风干燥箱、BPH-9162恒温培养 箱:上海慧泰仪器制造有

LDZF-30KB灭 :甜米酒产业化道路的必经之路。随科技水平的飞速蔡海莺，等：甜米酒酒*微生物分离和菌种鉴定----206 —表1米酒酒曲编号及来源Table 1 Sources and codes of Chinese sweet rice wine starters生物工程序号12编号XG1XG2SZ3酒曲产地序号78编号DZ7DZ8酒曲产地四川达州四川达州

孝感风味酵母孝感甜酒曲湖北孝感湖北孝感江苏苏州大竹东柳亿家醪糟大竹东柳醪糟曲安徽阜阳甜酒曲徐侬坊传统植物3456苏州小蜜蜂91011BY9YY10安徽阜阳湖南岳阳浙江绍兴浙江绍兴LS4丽水力克南宁广龙特甜黔东甜酒曲浙江丽水NN5广西南宁贵州黔东SS11SS12酵母绍兴风味QD612绍兴黄酒上海申安医疗器械有限公司;DYY-6C电泳仪:北京六 段扩增采用通用引物27F和1492R[11]: 5^-AGAGTTT-

GATCCTGGCTCAG-3'和 5^-GGTTACCTTGTTACGA- CTT -3、PCR扩增以菌株提取的细菌基因组DNA为

一生物科技有限公司;Mastercycler pro聚合酶链式反

应（polymerase chain reaction, PCR ）仪：艾本德中国有

限公司;Bio-rad Ge】 Doc XR+

公司统:美国模板,PCR反应 50 “L）条件:正向 反向引物各

2 “L、模板DNA 1 “L、高保真DNA聚合酶KOD 2 “L、 10倍酶缓冲液5 !L和超纯水38 mL°PCR反应程序

因组DNA提取试剂盒、酵母基因组DNA

提取试剂盒:天根生化科技（北京）有限公司。1.3为:95 C预变性5 min；95 C变性30 s,55 C复性

0.5 min, 72 CAB 1min,30个循环;72 C末端补齐延

鲁里亚贝塔尼（luria-bertani, LB ）细菌培养基:

0.5 %酵母提取物，1 %胰蛋白豚，1 %

1.5%伸 10 min。DNA提取采用酵母基因组DNA提取试

水1 L 121 °C高压灭菌20 min。固体LB培养基:LB细菌剂盒 采用rRNA 因ITS序列片段进行 子生物学鉴定。ITS扩增引物为ITS1和ITS4问S-TCCG-

TAGGTGAACCTGCGG-3'和 5-TCCTCCGCTTATTG-

酵母膏腺葡萄糖（yeast extract peptone dextrose,

YPD

:1 %酵母,2%

1.5%,2%葡萄糖，ATATGC-3、PCR扩增体系和反应程序同细菌16S rRNA片段PCR扩增。PCR扩增效率 1 %

徭水1 L,pH6.0,115 C湿热灭菌20 min。固体培养基： 应

1.4酒曲微生物的分电泳确认目片段送至江苏金维智生物技术

有限公司测序。1.6微生物多样性系统发育分析细菌和真菌的分离和培养[10]:取12种酒曲每种 样品1g,

10 mL 生 水，测序结果 建

生物多性 统发育树构样品菌含量调整稀释倍数，取终浓度是10C10-4、

10-5 g/mL和eVg/mL的酒曲样品溶液0.1 mL,均匀涂LB和YPD

DNA扩增片段序列上传至NCBI 库在线软件 BLAST （https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）,

获得与目的菌株片段序列相似性较

16S rRNA{YPD含终浓度0.1 mg/L四环链 ） 上

LB YPD生物ITS因序列。进一步MEGA7软件构建系统

发育树

应的37 C和28 C,2结果与分析属及其的系统发育关分别置于37 C和28 C,细菌培养1 d~2 d,真菌培养

2d~4d 取 上 LB YPD2.1

形态观察米酒

54

转移到LB和YPD

1.5

质、风味、安全性生产效率与酒曲中200 r/min摇床培养16h和24 h,直到培养液完全浑浊。微生物有重要关 本研究从12种酒曲

编号 为 bM-N46子生物学鉴定DNA提取采

因组DNA提取试M-N（M分别为12 酒曲样品编号1~12,N分别为同

剂盒 采用16S rRNA 因片段进行分子生物学一 生物序号）。甜米酒 类鉴定。细菌菌株16S rDNA序列扩增:16S rRNA基因片 统计见表2。生物工程蔡海莺，等：甜米酒酒曲微生物分离和菌种鉴定207 —

表2甜米酒细菌和真菌分离种类统计真菌一样,部分细菌分泌淀粉水解酶系分解淀粉生成

Table 2 Numbers of bacterialand fungal species isolated from，另外，细菌在该微生态 系中 生的Chinese sweet rice wine、、、 物 米酒的味形成意义重大。然

总数5菌株编号XG1XG2SZ3细菌种类222真菌种类3275而,酒曲中菌株种类的多少和微生物总数量并 直接

系，微生物总数量主要 种 中 菌种的数量 定，从菌落微生物计数结果表明,XG1、XG2、SS11和

SS12有较的菌数.4/。不同微生物种类和组成构成的

499LS4NN5QD64733微生物菌 , 过 生、 和 系71468米酒酿制过程中的微生态，从 米酒 的产35DZ7DZ8和 味[13-14]=米酒酒曲微生物的鉴

仅 于 在

作 来5534559, 于 的制，米酒中微生物的 ，BY9YY101088分离培养的微生物,凹从酒曲中分离 3类酵母菌（酒 酵母、

丝酵母 和 酵母 和 2 类根 菌 米根 和

SS11SS1255463510100根 从米酒酒曲中 的微生总数54物， ！-基 的种微生物问， 酶的微生物菌株网。生物 的，米酒酿制过程 中的微生物的 样 的

也

[17-19],类米酒生物多酒曲微生物的分离鉴定结果表明，从12种不同来

源的酒曲分离到46株细菌和54株真菌。不同来源的 酒曲微生物种类数量有较大差异,NN5酒曲分离到14

也为米酒微生物的分离 =2.2细菌和真菌分生物鉴种微生物,BY9和SS12也分离到10种微生物,而

XG2和XG1仅分别分离到4种和5种。根据培养基来

酵 微生物资源的重要来源。通，结 形态过分 生物 基 的

源、菌落形态和细胞形态观察，分离的真菌中以酵母 观察， 用的快速菌种鉴手段。本 择为主,少量丝状真菌，表明甜米酒中的酒精主要来源 到的46株细菌和16株长 良好的酵母形态和丝

于酵母。另外，分离得到的细菌种类与真菌种类接近, 表明细菌也在甜米酒酿制过程中起重要作用,和丝状状真菌的真菌，其基 DNA进行PCR扩增。细菌

16S rRNA基因V3〜V4区扩增结果见图1 =皿壮叭沁W巒M为DL2000标准品=图1细菌16S rRNA基因片段PCR扩增电泳结果Fig.l Electrophoresis of PCR products of bacterial 16S rRNA gene fragment由图1可知，仅少量菌株没有明显目的条带，其余

41个样品PCR扩增均获得约1.5 kb大小的 的 ，

带大小有一定差异，在约0.75 kb到1.5 kb之间。其中,

2株扩增条带明显,14株显示有少量扩增。表明真菌在 DNA 取和PCR扩增效率较细菌明显偏低，可 受

用于 的基 测=然而，与细菌不同，真菌中获得目 的基因ITS序列的PCR扩增 带的很少，并且扩增条到细胞壁破碎难度较大和真菌自身次级 物的蔡海莺，等：甜米酒酒曲微生物分离和菌种鉴定208影响。对41株细菌和16株真菌PCR扩增产物进行测

生物工程MEGA7软件构建了酒曲中细菌和真菌的系 树。序，获得了细菌16S rRNA基因V3〜V4区和真菌18S

rRNA基因ITS序列。酒曲 分离的芽抱杆菌菌株系 株系统发育树见图2和图3。树和其他细菌菌2.3进化树和多样性分析酒曲微生物 大量芽抱杆菌属(Ba+illus 2,鉴DNA测序结果经BLAST在线软件比对，并用定出的细菌 有8株与 芽抱杆菌(Bacillusb4-2b8-8b12-1b1-165

b8-4b5-7b7-1b5-5KY604958.1 Bacillus velezensis b4-1KX783537.1 Bacillus subtilis 54b10-1b11-5b3b826b2b2b8b947b5

b11-1T KR055727.1 Bacillus sp.- KY604959.1 Bacillus amyloliquefb6-18488b6-2b6-356-----------------------------------------------□L JN707686.1 Bacillus subtilis95

—b11-4—b11-2100■ MF765307.1 Bacillus sp.50b8-5b11-383b12-4b12-3b7-2b7-3MF101172.1 Bacillus atrophaeus

I KP245791.1 Bacillus licheniformis

—^00丄4-3I0.01

KX768313.1 Bacillus sp. b4-4MF526969.1 Bacillus cereus100] MF429096.1 Staphylococcus haemc—-b5-4图2酒曲中分离的芽5杆菌菌株系统发育树Fig・2 Phylogentic tree of Bacillus isolated from CSRW starters71 b9-255f b9-4100KU364466.1 Cronobacter sakazakii

63 KU891835.1 Escherichia sp=—b8-656\" EU675644.1 Enterobacter sakazak100 b3-258=HQ322393.1 Enterobacter hormaec93 28---------------b5-3b10-2-KM021236.1 Enterobacteriaceae-bb5-6____ KX170832.1 Klebsiella pneumoniab10-3360.005图3酒曲中分离的其他细菌菌株系统发育树Fig.3 Phylogentic tree of other bacteria isolated from CSRW startersvelezensis!同源关系最近，10株与枯草芽抱杆菌 licheniformis )同源关系最近，1株(b4-4)与蜡样芽抱杆

｛Bacillus subtilis 2同源关系最近,3株与解淀粉芽抱杆 菌｛Bacillus cereus)同源关系最近，还有2株与枯草芽 抱杆菌｛Bacillus subtilis)有一定的同源性，还有5株仅

能鉴别到芽抱杆菌属(Bacillus 2。酒曲的制作通常是通

菌(Bacillus amyloliquefaciens )同源关系最近,2 株(b7- 2和b7-3)与萎缩芽抱杆菌(Bacillus atrophaeus)同源

关系最近，b4 -3与地衣形芽抱杆菌(Bacillus 过淀粉含量较高的食品为固体原料(如小麦粉和米饭生物工程蔡海莺，等：甜米酒酒曲微生物分离和菌种鉴定209 —

haemol&t.cus)、阪崎氏肠杆菌(Cronobacter sakazak..)、

等),在有氧条件微生物自然发酵而成。酒曲从有氧环 境富集微生物的这一特性导致酒曲微生物中含有大

埃希氏菌属(Escherichia)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella

pneumonia)等的同源微生物，中 性

量芽抱杆菌。然而芽抱杆菌在米酒的酿制过程中可提 菌和供少量淀粉酶和风味物质前体,在后期酒精浓度较高 时生长受到抑制,乳酸菌的含量会相对较高叫蜡样芽

肺克 菌等一定

酒曲的制

的条件致病菌。这一发的 和制 ,抱杆菌是常见的腐败菌，赵东在研究西藏青｛酒酒曲 微生物多样性也鉴定 菌[20]o芽抱杆菌，酒曲

米酒的发酵过程中 致 菌和腐败菌,生物 系统发

性的风。酒曲中 的菌微生物菌株见 4。微生物中 到 性 菌(Stap h&loc oc c us7-3KP223720.1 Saccharomyces cerevisiae36KP674648.1 Saccharomyces cerevisiae

11-155KY105003.1 Saccharomyces cerevisiae99KP675519.1 Pichia kudriavzevii87s jibuligera8.1 Rhizopus or&zaeGQ502277.1 Rhizopus microsporus--------------12-1Mucor indicusKT336541.1 Mucor circinelloides1000.05图4酒曲中分离的真菌微生物菌株系统发育树Fig.4 Phylogentic tree of fungi isolated from CSRW starters的 酒

精微生物酿酒酵 Saccharomyces cerevisiae , 发酒精微生物,

酵 Pichiakudriavzevii)和米根霉(Rhizopus oryzae^)等叫 另夕卜，扣

米酒中有 富的 菌微生物 。 少量病原菌和腐败菌，说明部分中国传统发酵食品还 有一定的生物 隐患， 不断创新、转升级才 能迎发酵

的工业代化。酒曲中还有很多真菌微生物资源，过分离纯化的微生物 可用于甜米中发酵 的囊复膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)等非酒精 酵母也出现在酒曲微生物中。有 到 菌可 过 酿酒酵 的 和 生

酵酒酒曲制作和米酒酿制，也可以用

研究开发。经过鉴定的 微生物的利用，往往可的发酵 的 质和风味；时，科学的微生物搭配

量，并改变发酵液中风味物质的生成!22-23#,未来对于非 可改善发酵食品的原料利用效率，减少了病原菌和 腐败菌对

性的潜在 胁，是 发酵 发酵剂的研究方向之一。酿酒酵 酿酒酵 的 研究,有 对和 酒精发酵 提供 导。 ，酒曲 菌微生物试验的还鉴定了卷枝毛霉(Mucor circinel-

loides \"和印度毛霉菌(Mucor indicus \"的存在。参考文献：[1] 刘程，谢广发,孙剑秋，等.我国黄酒酿造微生物的研究进展[J].食

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