可溶性GST-CRH蛋白原核表达条件的优化及纯化

郁硕;陈锋;刘英富;霍景瑞;李光宗;张益;丁辉;樊毫军

【摘 要】目的：通过谷胱甘肽巯基转移酶（GST）-促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）原核表达条件的优化及纯化，获得可溶性好、纯度高的重组GST-CRH蛋白。方法通过对GST-CRH转化菌表达温度、菌液密度（OD600）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度以及诱导时间的摸索，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测可溶性GST-CRH蛋白的表达情况，GST琼脂糖凝胶进行GST-CRH的纯化，Western Blot对表达的目的蛋白进一步鉴定。结果起始OD6000.8、IPTG工作浓度0.1 mmol/L、30℃诱导8 h为GST-CRH最优诱导条件；融合蛋白经Western Blot鉴定为表达的GST-CRH，纯化后纯度＞95%。结论建立了GST-CRH的原核表达及纯化方法，获得了高纯度的GST-CRH可溶性蛋白。%Objective To obtain the recombinant corticotropin releasing hormone (CRH) protein with soluble, high purity protein through optimizing prokaryotic expression condition and purifying glutathione thiol transferase (GST)-CRH protein. Methods To detect the expression of soluble CRH protein through grope of the host strain GST-CRH temperature of induction expression, the host strain concentration (OD600), IPTG concentration and induction time, the purification of GST-CRH was performed by GST-CRH agarose gel. Western Blot assay was used for the expression identification of the target protein. Results The optimal conditions for the induction of CRH protein were determined: temperature of 30 ℃, IPTG induced concentration 0.1 mmol/L, bacteria density (OD600) 0.8, the induction time of 8 hours, purified GST-CRH>95% fusion protein

was obtained. Conclusion The optimal expression conditions of GST-CRH are obtained, and the soluble protein of high purity GST-CRH is also obtained.

【期刊名称】《天津医药》 【年(卷),期】2017(045)002 【总页数】5页(P146-150)

【关键词】促肾上腺皮质素释放激素;谷胱甘肽巯基转移酶;原核表达;纯化 【作 者】郁硕;陈锋;刘英富;霍景瑞;李光宗;张益;丁辉;樊毫军

【作者单位】河南新乡医学院附属医院呼吸内科 邮编453000;武警后勤学院附属医院救援医学研究所;武警后勤学院细胞生物学教研室;武警后勤学院附属医院救援医学研究所;武警后勤学院附属医院救援医学研究所;武警后勤学院附属医院救援医学研究所;武警后勤学院附属医院救援医学研究所;河南新乡医学院附属医院呼吸内科 邮编453000 【正文语种】中 文 【中图分类】R392-33

促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）能够刺激垂体促肾上腺皮质激素的释放［1］，是下丘脑-垂体-肾上腺轴的主要调节者［2］，在应激反应中发挥着重要的调节作用。然而，当CRH过多分泌处于高水平时往往会引起系列疾病的发生，例如焦虑、睡眠障碍、心血管疾病、代谢以及免疫功能障碍，此外CRH参与神经、精神类疾病的病理生理过程。CRH不仅能够调节应激反应，还能够在下丘脑-垂体-肾上腺调节轴中作为递质参与传递信息、情感

产生和精神紊乱等过程［3-6］，与药物成瘾行为［7］、老年痴呆症发生的性别差异［8］都存在着密切联系；研究显示在子宫内膜癌、前列腺癌、垂体腺瘤、卵巢癌患者中均可检测到CRH水平升高［9-10］，CRH能够增加异种移植肿瘤的生长和血管生成，提示CRH可能成为肿瘤治疗的一个重要靶点。吴雁等［11］研究表明，将大鼠放入低氧环境暴露2 h后，下丘脑分泌的CRH明显增加，血浆皮质酮水平显著升高，而且随着氧饱和度的降低，变化趋势更为明显，推测CRH可能在监测高原病中起到重要作用。

基于CRH在各种疾病中发挥的重要作用，笔者认为CRH相关检测试剂方面的开发具有较大的应用价值。然而CRH为小分子多肽，原核表达困难，本课题组前期构建的PET24a-CRH表达载体未能表达出CRH，在CRH相关检测抗体制备方面产生了一定的问题，因此如何实现CRH小分子多肽的表达、纯化，在CRH相关检测抗体研发方面具有重要意义。谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione S-transferase，GST）是一个常用的标签蛋白，将目的蛋白与GST融合表达，利用GST亲和层析填料一步纯化就能获得纯度很高的融合蛋白。本研究旨在对可溶性GSTCRH融合蛋白表达条件进行优化及纯化，为进一步制备CRH相关抗体奠定基础。

1.1 材料与试剂 大肠杆菌（E.coli）DH-5α、BL21（DE3）感受态细胞，质粒pGEX-4T-2均为本实验室保存；PCR引物由中美泰和生物技术有限公司合成；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和T4-DNA连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司；兔抗人CRH抗体、HRP标记羊抗兔二抗购自Abcam公司；GST琼脂糖凝胶购自GE公司，核酸分子质量标准、ECL化学发光液等产品购自北京康为世纪生物科技有限公司；蛋白分子质量标准购自Fermentas；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自Merck公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）等均购自

Amresco公司；其他化学试剂均购自国药集团北京化学试剂公司。 1.2 方法

1.2.1 重组质粒GST-CRH的构建 根据CRH的核酸序列（NM_000756.3）基因合成827～949序列长度，设计含BamHⅠ酶切位点上游引物（3′-cGGATCCgaggagcctcccatctccctg-5′）和含 NotⅠ酶切位点的下游引物 P2（3′-cgGCGGCCGCaataatctccatgagtttcctg-5′）。取浓度为10 μmol/L的上述引物各2 μL、pfu聚合酶0.5 μL、CRH合成基因模板1 μL、10 mmol/L dNTP 2 μL、10×pfu Buffer 2 μL、ddH2O 10.5 μL充分混合后，进行PCR反应，退火条件为58℃30 s，延伸条件为72℃30 s，经30轮扩增后，PCR扩增产物、pGEX-4T-2空载体BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切，酶切产物T4-DNA连接酶连接并转化E.coli DH-5α，再进行涂板，挑单克隆菌液PCR检测，最后选取阳性克隆进行测序。 1.2.2 GST-CRH在BL21（DE3）表达的优化 经测序验证后，将阳性重组质粒pGEX-4T-2-CRH转入E.coli BL21 （DE3）中，在琼脂平板上培养过夜，挑取饱满的菌落，在含氨苄抗性的LB培养基中培养过夜，然后以5%接菌量转接至新鲜LB抗性培养基中培养，考察如下几个影响目的蛋白表达水平的因素。（1）不同诱导温度对可溶性GST-CRH表达的影响。37℃培养GST-CRH转化菌30 mL，菌液密度OD600至0.6时，加入IPTG使其终浓度维持在0.1 mmol/L，分别于20℃、25℃、30℃、37℃不同温度下诱导4 h，收集诱导后的细菌并破碎，破碎后的上清和沉淀经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，根据对应条带可溶性蛋白的表达量确定GST-CRH表达的最佳诱导温度。（2）不同浓度IPTG对可溶性GST-CRH表达的影响。转化菌30 mL，37℃振荡培养至OD600为0.6时，分别加入不同体积的IPTG母液（1 mol/L）使其终浓度维持在0.01、0.05、0.1、0.5 mmol/L，参照温度筛选结果设定的诱导温度诱导4 h，收集诱导后的细菌并破碎，破碎后的上清和沉淀经SDS-PAGE检测，根据对应条带

可溶性蛋白的表达量确定GST-CRH表达的最佳IPTG诱导浓度。（3）不同OD600对可溶性GST-CRH表达的影响。转化菌30 mL，37℃振荡培养，选择0.6、0.8、1.0 3个不同的细菌密度作为初始诱导密度，在上述筛选的诱导温度和IPTG浓度条件下诱导4 h，收集诱导后的细菌并破碎，破碎后的上清和沉淀经SDS-PAGE检测，根据对应条带可溶性蛋白的表达量确定GST-CRH表达的最佳菌液密度。（4）不同诱导时间对GST-CRH蛋白可溶性表达量的影响。转化菌30 mL，37℃振荡培养，在上述筛选的诱导温度和IPTG浓度，摇菌200 mL至OD600为0.8时加入IPTG使其浓度为0.1 mmol/L，温度设定为30℃，诱导时间分别设定为4 h、8 h、12 h，收集诱导后的细菌并破碎，破碎后的上清和沉淀经SDSPAGE检测，根据对应条带可溶性蛋白的表达量确定GSTCRH表达的最佳诱导时间。

1.2.3 GST-CRH的纯化及鉴定 在优化后的GST-CRH表达条件下，摇菌2 L并诱导GST-CRH表达，-80℃反复冻融2次，超声碎裂后12 000 r/min离心15 min后收集上清，该蛋白经过GST琼脂糖凝胶纯化，5 mmol/L谷胱甘肽进行洗脱，蛋白凝胶电泳分析纯化效果。

1.2.4 Western Blot验证 以实验室前期纯化的GST蛋白作为对照，用5×样品处理液对GST和GST-CRH纯蛋白适当处理后，经12.5%SDS-PAGE凝胶电泳，利用Bio-RAD转膜仪转膜，用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h后，加兔抗人CRH抗体，室温孵育2 h；一抗孵育后，依次经洗膜、酶标二抗孵育、洗膜、ECL发光后，将PVDF膜移入X射线摄影暗盒，暗室中曝光，观察结果。1.3 统计学方法 电泳图采用ImageJ2x软件进行表达量的分析，对GST-CRH上清表达量/总蛋白数值用统计软件SPSS 16.0进行数据分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行Turkey检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 重组质粒构建及鉴定 pGEX-4T-2-CRH连接产物菌液PCR检测结果显示，挑选的6个菌落中有5个阳性菌落在100～250 bp处检测到条带，与CRH基因大小相符、测序正确，结果证实成功构建pGEX-4T-2-CRH表达载体。见图1。 2.2 目的蛋白表达条件的优化

2.2.1 诱导温度对GST-CRH表达的影响 与诱导温度20℃、25℃比较，30℃诱导时可溶性GSTCRH的表达量明显增加（P＜0.01），随着温度的升高，37℃时GST-CRH主要以包涵体的形式存在，可溶性表达降低（P＜0.05），因此30℃可作为优化后的诱导温度，见图2、3。

2.2.2 诱导剂浓度对GST-CRH表达的影响 与0.01 mmol/L、0.05 mmol/L组比较，0.1 mmol/L诱导浓度条件下，GST-CRH表达量明显增加（P＜0.05），随着IPTG浓度进一步提高至0.5 mmol/L，可溶性表达较0.1 mmol/L时未有明显变化，表达趋于稳定。见图4、5。

2.2.3 诱导初始细菌密度对GST-CRH表达的影响 与OD6000.6比较，OD6000.8时GST-CRH表达量明显增加（P＜0.05），而随着OD600进一步增加至1.0时，GST-CRH表达量较OD6000.8时无明显变化，表达趋于稳定。见图6、7。 2.2.4 诱导时间对GST-CRH表达的影响 利用上述筛选得到的结果，在细菌

OD6000.8时，加入0.1 mmol/L的IPTG，30℃条件下诱导，分别在诱导后4、8、12 h时取样，SDS-PAGE电泳检测不同诱导时间GST-CRH的表达，结果显示，8 h和12 h时可溶性GST-CRH表达量明显多于4 h，8 h与12 h比较差异无统计学意义，见图8、9。

2.3 GST-CRH纯化及鉴定 在可溶性GST-CRH优化后的表达条件下。扩大培养摇菌2 L，选择诱导剂IPTG浓度为0.1 mmol/L，OD6000.8、30℃条件下诱导8 h，收集超声破碎上清进行GST-CRH蛋白纯化，获得纯度＞95%GST-CRH，见图10。经抗CRH抗体对纯化的GST-CRH进行Western Blot检测，前期纯化的GST作

对照，结果显示，GST-CRH泳道中能够观察到印迹条带，而GST纯蛋白泳道没有显影条带出现，证明纯化得到的蛋白是GST-CRH融合蛋白，见图11。 CRH分子质量很小，只有4 600 u左右，CRH分布非常广泛，皮肤、免疫系统、胰腺、肝脏、胃肠道等多种机体组织器官中均检出其存在［12］。CRH蛋白具有重要的生物学功能，在炎症发生、血管形成等过程中表现尤为突出［10］，CRH参与的炎性反应能够加快内皮细胞对局部应激的适应［13］。最新研究表明，CRH含量的变化还可以预示急性高原病（acute mountain sickness，AMS）的发生，对体内CRH水平的检测，可以预判进入高原人群发生AMS的可能性及病情的严重程度［14］。因此CRH在疾病诊断方面具有潜在的应用价值。

在CRH检测方面的研究、抗原获取及相应抗体制备是开展CRH检测研究的基础，CRH为小分子多肽，而小分子肽类物质在表达过程中由于分子质量小，易被宿主蛋白酶识别，并降解为无活性的寡肽片段，难以获得表达产物。目前解决这一问题常用的方法主要通过小分子肽串联表达或与大分子蛋白（KLH、GST等）融合来实现其表达。在本课题组前期实验的探索中，小分子肽串联后主要以包涵体的形式存在，考虑包涵体后期复性的困难，因此选择将CRH构建到pGEX-4T-2进行融合蛋白的表达。PGEX表达系统会在目的蛋白N端融合表达26 ku左右的GST蛋白，该蛋白不仅可溶性很高，而且为还原性蛋白，能明显促进目的蛋白的正确折叠。为获得高纯度的目的蛋白，已经开发的GST亲和纯化填料，对GST融合蛋白经过一步亲和纯化，往往能获得较高纯度的目的蛋白。本研究采用GST琼脂糖凝胶纯化后的GST-CRH蛋白纯度可达95%，对于后期抗体制备提供了较好抗原。 在进行CRH-GST表达的过程，虽然有较多的研究报道了GST以可溶性表达为主［15-16］，而进行GST-CRH融合蛋白表达时，仍然存在大量的包涵体表达，由于诱导温度、IPTG浓度、菌液密度（OD600）、诱导时间都有可能影响GST融合蛋白的可溶性，为获得GST-CRH的高可溶性表达形式，本研究对表达条件进行

了优化。结果显示，随着IPTG浓度、细菌密度（OD600）、诱导温度升高至一定程度，可溶性表达逐步趋于稳定，而诱导温度却存在着较大的差异，随着诱导温度的升高（20～37℃），CRH-GST的表达量虽然有很大的提高，而可溶性表达在30℃达到峰值后，可能由于诱导温度过高，导致蛋白的表达速度加快，37℃诱导下，包涵体的表达量增加，而可溶性表达降低，因此适宜的表达温度同样是GST-CRH可溶性表达的重要影响因素。通过对以上条件的摸索，最终建立了GST-CRH的最优可溶性表达条件（温度30℃，IPTG 0.1 mmol/L，OD6000.8，时间8 h）。

良好抗原的获取是抗体制备的前提，GST-CRH可溶性表达条件的建立以及CRH可溶性抗原的获得，为CRH抗体制备及CRH相关疾病的检测研究奠定了基础。

【相关文献】

［1］Steckler T，Holsboer F.Corticotropin-releasing hormone receptor subtypes and emotion［J］.Biol Psychiatry，1999，46（11）:1480-1508.doi:10.1016/S0006-3223（99）00170-5.

［2］Arborelius L，Owens MJ，Plotsky PM，et al.The role of corticotropinreleasing factorin depression and anxiety disorders［J］.J Endocrinol，1999，160（1）:1-12.doi:10.1677/joe.0.1600001.

［3］Beurel E，Nemeroff CB.Interaction of stress，corticotropinreleasing factor，arginine vasopressin and behaviour［J］.Curr Top Behav Neurosci，2014，18:67-80.doi:10.1007/7854 2014 306.

［4］Yu Y，Liu ZQ，Liu XY，et al.Stress derived corticotropin releasing factor breaches epithelial endotoxin tolerance［J］.PLoS One，2013， 8（6）:e65760.doi:10.1371/journal.pone.0065760.

［5］Bangasser DA，Kawasumi Y.Cognitive disruptions in Stress Related psychiatric disorders:A role for corticotropin releasing factor（CRF）［J］.Horm Behav，2015，76:125-135.doi:10.1016/j. yhbeh.2015.04.003.

［6］Koob GF，Zorrilla EP.Update on corticotropin-releasing factor pharmacotherapy for psychiatric disorders:a revisionist view［J］. Neuropsychopharmacol，2012，37:308-309.doi:10.1038/npp. 2011.213.

［7］Sarnyai Z，Shaham Y，Heinrichs SC.The role of corticotropinreleasing factor in drug addiction［J］.Pharmacol Rev，2001，53（2）: 209-243.

［8］Bangasser DA，Dong H，Carroll J，et al.Corticotropin-releasing factor

overexpression gives rise to sex differences in Alzheimer’s disease-related signaling［J］.Mol Psychiatry，2016 Oct 18.doi: 10.1038/mp.2016.185.［Epub ahead of print］. ［9］Song H，Park H，Park G，et al.Corticotropin-releasing factor induces immune escape of cervical cancer cells by downregulation of NKG2D［J］.Oncology Reports，2014，32（1）:425-430.doi: 10.3892/or.2014.3191.

［10］Im E.Multi-facets of Corticotropin-releasing Factor in Modulating Inflammation and Angiogenesis［J］.J Neurogastroenterol Motil，2015，21（1）:25-32.doi:10.5056/.jnm14076.

［11］吴雁，杜继曾.低氧暴露对大鼠下丘脑CRF分泌的影响［J］.中国应用生理学杂志，2002，17（1）:317-319.Wu Y，Du JZ.Effect of hypoxia on activity of hypothalamo-pituitary-cortex axis in rat. ［J］.Chinese Journal of Applied Physiology，2002，17（1）:317-319.doi:10.3969/j.issn.1000-6834.2001.04.002.

［12］Slominski A，Wortsman J，Pisarchik A，et al.Cutaneous expression of

corticotropin-releasing hormone（CRH），urocortin，and CRH receptors［J］.Faseb J，2001，15（10）:1678-1693.

［13］Gougoura S，Liakos P，Koukoulis GN.Effect of CRH on NO bioavailability，ROS production and antioxidant defense systems in endothelial EAhy926 cells［J］.Free Radic Res，2010，44（7）:803-812.doi:10.3109/10715762.2010.485988.

［14］孔繁平.神经肽CRH作为急性高原低氧应激损伤的生物标志分子研究［D］.浙江:浙江大学，2013:1-94.Kong FP. Neuropeptide CRH promise as a biomarker for evaluating hypoxic injury by acute high altitude hypoxia［D］.Zhejiang:Zhejiang University，2013:1-94. ［15］范芳芳，孙慧莹，徐晖，等.重组阳离子抗肿瘤肽AIK的原核表达、纯化及活性测定［J］.生物工程学报，2015，31（12）:1753-1763.Fan FF，Sun HY，Xu H，et al.Expression，purification of recombinant cationic peptide AIK in Escherichia coli and its antitumor activity［J］.Chin J Biotech，2015，31（12）:1753-1763. doi:10.13345/j.cjb.150072. ［16］Hu Y，Yang A，Fang N，et al.The Optimization of Soluble PTEN Expression in Escherichia coli［J］.Open Biochemistry Journal，2015，9（1）:42-48.doi:10.2174/1874091X01509010042.