‘黄花梨’2个?CYP707A?基因的克隆和序列分析

‘黄花梨’2个CYP707A基因的克隆和序列分析

作者：黄添毅 李亮 余雪芳等 来源：《安徽农业科学》2015年第06期

摘要[目的]探讨脱落酸（Abscisic acid，简称ABA）分解途径关键酶基因（CYP707A）的特性，以期为揭示ABA调控梨花芽休眠进程的分子机制奠定基础。[方法]根据已公布的梨基因组数据库，通过本地blast的方法获得梨基因组CYP707A序列，运用DNAMAN软件设计引物，获得„黄花梨‟的2个脱落酸8‟羟化酶基因的CDS序列，分别命名为PpCYP707A4（Genbank登录号：KP279630 ）和PpCYP707A5（Genbank登录号：KP279631 ），并利用在线分析平台和生物软件进行生物信息学分析。[结果]PpCYP707A4的CDS序列全长分别为1 431 bp，编码476个氨基酸；PpCYP707A5的CDS序列全长为1 425 bp，编码474个氨基酸，两者同源性94.27%，氨基酸相似性94.96%，两者与苹果的2个基因在系统发育树上分别独自聚为一小支。[ 结论]PpCYP707A4和PpCYP707A5为同属于梨PpCYP707A家族2个相似度较高的基因，它们可能发源于苹果和梨的共同祖先。 关键词梨； 休眠；CYP707A； 克隆； 序列分析

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-078-04

„黄花梨‟是我国南方主栽的一个砂梨品种，属于蔷薇科（Rosaceae）梨属植物（Pyrus L.），具有良好的风味、丰富的营养，是优良栽培品种之一，栽培范围遍布我国长江流域以南地区，在福建省广受人们的喜爱，福建建宁县更有“黄花梨之乡”的美称。„黄花梨‟具有落叶果树共有的特性，其花芽在冬季会经历休眠，并需要足够的低温积累量才能解除休眠，廖光升[1]认为„黄花梨‟在建宁栽植时花芽休眠期在11月～次年3月份，并需5 ℃以下低温750 h才能打破自然休眠。如能缩短„黄花梨‟休眠期，将有利于该优良品种的向南推广，但梨休眠生理机制仍很不清楚阻碍了短低温梨育种，不利于扩大梨生长种植南限。因而研究梨花芽休眠的分子机制，阐明梨花芽休眠进程，对于短低温梨育种和早熟梨品种在我国南方推广栽培，促进南方梨产业发展具有重大意义。

脱落酸（Abscisic acid，简称ABA）是植物生长调节剂之一，可以在多种组织中活跃地运转，其作用贯穿于从种子萌发到生殖发育的植物生命周期，介导多种生理过程[2]。研究表明ABA是花芽休眠的促进物和萌发的抑制物，其含量与GA3含量的比例变化对花芽休眠的进程有重要影响[3]。ABA分解途径上关键调控酶ABA 8‟-羟化酶的编码基因被证实为CYP707A，对ABA的含量变化有重要作用[4-6]。CYP707A蛋白结构、基本性质等是研究ABA调控梨花芽休眠进程分子机制的重要内容。笔者从„黄花梨‟克隆到2个CYP707A基因，分析CDS序列，探讨生物学信息特征，为进一步分离酶蛋白和研究其功能、活性及阐明CYP707A在„黄花梨‟花芽休眠过程中的调控模式提供理论基础。

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1材料与方法

1.1试验材料„黄花梨‟花芽采自福建省建宁县，选取长势健壮梨树作为采样母株。样品取回后，挑取饱满的芽体，去芽鳞片和绒毛，挑取花芽，经液氮速冻于-80 ℃冰箱贮藏。试验在福建农林大学园艺学院，于2014年1～7月进行。

1.2 主要仪器冷冻离心机（eppendorf 5810R）、PCR仪（BIORAD T100TM Thermal Cycler）、 水平电泳槽（DYCP31DN型）、电泳仪（DYY10C）、凝胶成像仪（BIORAD Universal HoodⅡ）、振荡器（IKA MS 3 B S25）、紫外分光光度计（Quawell q5000，USA）。

1.3总RNA提取和cDNA合成液氮研磨花芽后用Biospin多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（博日科技有限公司，中国杭州）提纯RNA，并用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。选用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒（北京全式金有限公司，中国北京）合成„黄花梨‟cDNA，-20 ℃保存备用。

1.4基因克隆以NCBI数据库下载已登录的蔷薇科CYP707A基因序列作为参考，通过Bioedit软件（版本号：v7.0.9）的blast功能从梨基因组CDS数据库（Pear Genome Project网站http：//peargenome.njau.edu.cn：8004/）获得同源序列；将同源序列返回到NCBI网站在线blast验证；而后以梨基因组CDS数据库得到的2条序列为参照，设计引物。PCR反应体系25 μl（模板1 μl，10 μmol/μl上游引物1 μl，10 μmol/μl下游引物1 μl，10 mmol/L dNTP mixture 1 μl，10×ExTaq Buffer 2.5 μl，5 U/μl EXTaq 0.15 μl，ddH2O 1835 μl），目的基因扩增引物见表1。以„黄花梨‟花芽总RNA逆转录成的cDNA为模板进行PCR扩增。反应程序：94 ℃预热5 min；94 ℃变性45 s，48～55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min；共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。凝胶电泳检测PCR扩增产物（图1），并切下1 400 bp左右的目的条带，经胶回收（EasyPure Quick Gel Extraction Kit，北京全式金有限公司，中国北京）纯化，连接到PMD18T（Takara，中国大连）上，后转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，在AMP培养基培养大肠杆菌，将菌液PCR鉴定的阳性克隆送至英潍捷基贸易有限公司（中国上海）测序。 2 结果与分析

2.1 „黄花梨‟CYP707A基因的克隆从„黄花梨‟花芽上克隆得到2个CYP707A基因序列，通过DNAMAN比对，发现两者之间的相似性高达94.27%（图2），氨基酸相似性94.96%。为此，从梨基因组数据库找到2个基因的内含子和外显子基因组序列进行比对，结果显示其相似性为69.95%，说明这2个CYP707A基因为相似性较高的不同基因。将克隆到的„黄花梨‟CYP707A 基因分别定名为PpCYP707A4（Genbank登录号：KP279630）、PpCYP707A5（Genbank登录号：KP279631）。

PpCYP707A4的CDS序列全长为1 431 bp，编码476个氨基酸；其氨基酸序列与苹果（Malus domestica XP_008346457.1）相似性97%，与碧桃（Prunus persica XP_007210577.1）

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相似性90%，与梅（Prunus mume XP_008245093.1）相似性87%，与草莓（Fragaria vesca subsp. Vesca XP_004300683.1）相似性83%，与甜橙（Citrus sinensis NP_001275876.1）相似性84%。

安徽农业科学2015年PpCYP707A5的CDS序列全长为1 425 bp，编码474个氨基酸；其氨基酸序列与苹果（Malus domestica XP_008382035.1）相似性 97%，与碧桃（Prunus persica XP_007210577.1）相似性89%，与梅（Prunus mume XP_008245093.1）相似性86%，与草莓（Fragaria vesca subsp. Vesca XP_004300683.1）相似性84%，与甜橙（Citrus sinensis NP_001275876.1）相似性85%。

在线blastp分析，2个PpCYP707As基因均具有1个保守结构域，为PLN02196（图3），属于P450超基因家族。以PpCYP707A4和PpCYP707A5的氨基酸序列作为参考，从NCBI数据库上blast其他物种的CYP707A氨基酸序列，构建系统发育树。仅苹果blast到2个基因（XP_008346457.1、XP_008382035.1），其他物种均只blast到1个基因。系统发育树分析显示（图4），蔷薇科植物的CYP707A基因聚为一大支，PpCYP707A4与苹果XP_008346457.1基因，PpCYP707A5与苹果XP_008382035.1基因单独聚类。

注：a.„黄花梨‟总RNA； b.PpCYP707A4 PCR扩增； c.PpCYP707A5 PCR扩增。 图1电泳图谱图22个PpCYP707As的核苷酸序列比对注：a. PpCYP707A4蛋白的保守结构域； PpCYP707A5蛋白的保守结构域。

图3蛋白保守结构域图42个PpCY707As系统进化树2.2蛋白性质预测采用ExPASy ProtParam、TMpred、SignalP 4.1预测蛋白性质和Prot预测亚细胞定位，结果显示，PpCYP707A4蛋白的理论分子质量为54.4 kDa，理论等电点为9.01，不稳定系数为48.48，属于不稳定蛋白，分子式可写为C2493H3901N645O679S20，原子数7 338，带负电荷（Asp + Glu）氨基酸50，带正电荷（Arg + Lys）氨基酸59，脂溶系数为9239，GRAVY为-0.100，是亲水性蛋白；在6～23位点含有一个由内向外的跨膜螺旋结构，8～26位点有一个由外向内的跨膜螺旋结构；不含信号肽，为非分泌蛋白；并定位在内质网，概率为0.820。 PpCYP707A5蛋白的理论分子质量为54.1 kDa，理论等电点为9.03，不稳定系数为47.78，属于不稳定蛋白，分子式可写为C2481H3874N640O673S21，原子数7 689，带负电荷（Asp + Glu）氨基酸49，带正电荷（Arg + Lys）氨基酸59，脂溶系数为91.96，GRAVY为-0.089，是亲水性蛋白。在6～23位点含有一个由内向外的跨膜螺旋结构，8～27位点有一个由外向内的跨膜螺旋结构。与PpCYP707A4蛋白相同，也不含信号肽，为非分泌蛋白；定位在内质网，概率为0.820。

2.3蛋白结构预测采用Npsa-pbil、NetPhos 2.0 Server在线工具预测蛋白质二级结构、磷酸化位点。PpCYP707A4有243个氨基酸残基形成α-螺旋，32个形成β-螺旋，78个形成延伸链和132个形成无规则卷曲；有12个丝氨酸（serine，S）残基、7个苏氨酸残基（threonine，

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T），2个酪氨酸（tyrosine，Y）参与磷酸化过程。PpCYP707A5有226个氨基酸残基形成α-螺旋，27个形成β-螺旋，81个形成延伸链和140个形成无规则卷曲；有13个丝氨酸（serine，S）残基、6个苏氨酸残基（threonine，T），3个酪氨酸（tyrosine，Y）参与磷酸化过程。Swiss-model预测蛋白三级结构，结果显示PpCYP707A4、PpCYP707A5蛋白的QMEAN4值分别为-5.67、-4.79，三级结构存在较大差异（图5）。 注：a. PpCYP707A4蛋白三级结构； b. PpCYP707A5蛋白三级结构。 图5预测的2个PpCYP707A蛋白三级结构3 讨论

休眠的长短决定落叶果树的地理分布，是落叶果树的重要性状之一[7]。我国梨的种质资源大体分为北方品种群和南方品种群，北方品种群的特点为抗寒力较强、休眠期较长，南方品种群表现出早熟、休眠期短等优势[8]。„黄花梨‟在福建省建宁县能够正常开花结果，产量较大，而在纬度较低的福建省上杭县其萌芽不整齐的现象明显，休眠期的长短对于„黄花梨‟的产量和栽培具有重要的制约作用，休眠影响梨品种的选育和梨产业的发展，研究梨的休眠意义重大。对桃[3]、大樱桃[9-10]、欧洲甜樱桃[11]、葡萄[12]、牡丹[13]等的研究表明ABA的含量变化是影响木本植物芽休眠进程的重要因素。从分子水平探讨ABA调控梨花芽休眠进程的分子机制，将有利于构建梨休眠的调控网络，从而有助于梨品种的选育。

该研究从„黄花梨‟上分离到ABA分解途径关键酶基因PpCYP707A4和PpCYP707A5，采用生物信息学方法分析其核苷酸序列、氨基酸序列，构建相关系统发育树并预测蛋白结构。分析结果显示，PpCYP707A4与PpCYP707A5核苷酸序列和氨基酸序列相似度较高，为94.27%和94.96%，两者蛋白理化性质相近，符合家族基因的特点。系统进化树显示，„黄花梨‟的PpCYP707A4和PpCYP707A5与苹果的2个基因（XP_008346457.1、XP_008382035.1）分别单独聚类，而非PpCYP707A4和PpCYP707A5独自聚类。对苹果[14]、大豆[15]、剑兰[16]的研究结果也显示CYP707A家族基因在系统发育树并未单独聚为一类而是分散到几类中。梨基因组数据发表后，Wu等[17]认为蔷薇科的染色体是由祖先7个染色体发展形成的，梨和苹果基因组之间具有高共线性。该研究克隆的2个基因很可能产生于梨和苹果的共同祖先，而后遗传给梨和苹果。CYP707A是一个多基因家族，它们在不同组织中的转录模式不同[2]，以功能交迭的方式参与环境胁迫应答[4，18-19]、休眠解除[20]等不同的生理反应过程，共同调控植物体内源ABA的分解。因而，需进一步研究该基因家族各基因的特性，研究它们的生物学功能，为开展„黄花梨‟花芽休眠的研究提供信息，为短低温梨品种的选育奠定基础。 参考文献

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