高效液相色谱法测定西柚不同组织中的10种柑橘黄酮类化合物

物

王智聪;沙跃兵;余笑波;王珂

【摘 要】该文建立了圣草次苷、柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香风草苷、枸橘苷、甜橙黄酮、川皮苷和蜜橘黄酮等10种柑橘黄酮类化合物同时测定的高效液相色谱方法.色谱柱为Welch Ultimate XB-C18(5μm,4.6×150mm),采用甲醇-水(含0.1%甲酸)流动相体系,梯度洗脱,检测波长为280nm.方法学考察结果表明,对10种柑橘黄酮类化合物,提取效率均大于95%;在给定的范围内线性关系良好,相关系数r2均大于0.99;方法的精密度和重现性良好,相对标准偏差(RSD)分别小于5.4%和7.1%.该方法用于西柚不同组织中柑橘黄酮类化合物含量的测定,结果显示,柑橘黄酮类化合物在西柚果皮、囊衣和果瓣中的含量和分布差异显著. 【期刊名称】《安徽农学通报》 【年(卷),期】2016(022)018 【总页数】6页(P99-103,141)

【关键词】柑橘黄酮类化合物;西柚;不同组织;高效液相色谱法 【作 者】王智聪;沙跃兵;余笑波;王珂

【作者单位】浙江省计量科学研究院,浙江杭州 310018;浙江省计量科学研究院,浙江杭州 310018;浙江省计量科学研究院,浙江杭州 310018;浙江省计量科学研究院,浙江杭州 310018 【正文语种】中 文

【中图分类】TS201.1

西柚，又称葡萄柚，属芸香科柑桔属植物，由橙和柚天然杂交而成。西柚果实皮薄汁多，酸甜略带苦味，风味独特、口感好，具有较高的营养价值和药用价值，深受国内老百姓的喜爱。李时珍在《本草纲目》中记载：“柚，功能消食，解酒毒，去肠胃中恶气，长发滋燥，疗妊妇不思食口淡”。柚中含有多种对人体健康有益的活性物质，如黄酮类化合物、柠檬苦素类化合物和精油等［1-2］。现代医学研究表明，柚皮提取物具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗衰老、抑酶、降血糖和降血压等多种功能活性［3-7］。柑橘中的黄酮类化合物主要包括两类，一是黄烷酮类化合物，多以糖苷的型式存在，如圣草次苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮芸香苷、柚皮苷、香风草苷和枸橘苷等，其主要区别是黄酮母体结构A环-7位和C环-3′、-4′位置取代基因的差异；其中A环-7位以芸香糖苷和新橙皮糖苷为主，形成多种同分异构体，如橙皮苷/新橙皮苷、柚皮芸香苷/柚皮苷、香风草苷/枸橘苷等；二是多甲氧基黄酮类化合物，如甜橙黄酮、川皮苷和蜜橘黄酮等，主要区别在于黄酮母体结构A环-8位和C环-3′位甲氧基数目和位置的差异。

目前柑橘黄酮类化合物的测定方法主要有高效液相色谱法［8-11］和液相色谱-质谱联用法［12］等。李利改等［13］研究了不同种类柑橘的花、皮和叶中柑橘黄酮类化合物的分布；吴倩等［14］研究了常山胡柚的皮、肉和籽中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷等三种柑橘黄酮的含量分布。本文以西柚整果为研究对象，探讨了西柚可食部分（果瓣）及副产物（果皮和囊衣）等不同组织中柑橘黄酮类化合物的分布特征。

1.1仪器与试剂Alliance e2695高效液相色谱，配光电二极管阵列检测器和Empower 3数据处理系统（美国Waters公司）；AG285精密电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；5810R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；Christ冷冻干燥浓缩仪（德国Christ公司）；KQ-100DE数控超声仪（昆山超声

仪器有限公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。甲醇（色谱纯）购自德国Merck公司；甲酸（分析纯）购自美国Sigma-Aldrich公司；氨水（分析纯）购自上海国药集团；圣草次苷、柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香风草苷和枸橘苷标准品购自上海诗丹德生物技术有限公司；甜橙黄酮、川皮苷和蜜橘黄酮标准品购自上海同田生物技术有限公司；西柚购自当地超市。 1.2实验方法

1.2.1标准工作溶液的配制分别称取适量圣草次苷、柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香风草苷、枸橘苷、甜橙黄酮、川皮苷和蜜橘黄酮标准品，加适量甲醇（对橙皮苷，添加少量氨水）漩涡震荡、超声溶解，配制浓度均为2.00mg/mL的母液；再用甲醇和水序列稀释，配制浓度分别为10.0、15.0、20.0、30.0、50.0、100和200μg/mL的混合标准工作溶液，对橙皮苷，增加400、750和1 000μg/mL的标准曲线工作点，所有标准工作溶液中甲醇的体积含量约为50％。 1.2.2样品的制备取个头适中的西柚数个，用超纯水清洗外皮，并擦干；小心剥离果皮，果瓣去除囊衣；分别收集果皮、囊衣和果瓣，置于-35℃冰箱冷冻12h；再冷冻干燥72h；取出置于粉碎机粉碎，干燥密闭保存。分别称取适量上述制备的干燥果皮、囊衣和果瓣样品，按照1∶25的料液比，加50％的甲醇-水（体积比）溶液，超声提取30min，取出于7 000rpm离心10min，倒出上清液；残渣再按照上述方法提取1次；合并上清液，混匀，用超纯水稀释2倍后进行测定。 1.2.3液相色谱分析条件色谱柱：Welch Ultimate XB-C18（5μm，

4.6×150mm）；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；流动相A：含0.1％甲酸的水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱：30％B（0min）～30％B（2min）～50％B（15min）～70％B（18min）～90％B（25min）～98％B（26min）～98％B（30min）～30％B（31min）～30％B（35min）；紫外检测波长：280nm；进样体积：10μL。

2.1液相色谱分析方法的建立柑橘类水果成分复杂，既有极性较大的糖类、氨基酸类、有机酸类和酚酸类等，又有极性适中的黄烷酮类和极性较小的多甲氧基黄酮等，为了有效地进行组分的分离，实验比较了不同梯度洗脱方式对分离的影响。在梯度开始前采用较低比例的甲醇洗脱一定时间，有利于洗脱极性较大的干扰杂质而不影响目标组分的分离，待测化合物中圣草次苷的极性最大，保留因子k为3.14。待测化合物中有多种同分异构体，如柚皮芸香苷和柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷、香风草苷和枸橘苷、甜橙黄酮和蜜橘黄酮等，在优化的梯度条件下各组分均得到了良好的分离。10种柑橘黄酮类化合物的色谱如图1所示。

2.2样品提取条件的优化以西柚果皮为例，考察提取溶剂、料液比、提取时间及提取次数等对提取效率的影响。

2.2.1提取溶剂的优化称取冷冻干燥粉碎后的果皮样品1g（精确至0.001g）6份，按照1∶25的料液比，分别加入25mL 40％、50％、60％、70％、80％和90％的甲醇-水溶液（体积比），超声提取30min；取出于7 000r离心10min，上清液用超纯水稀释2倍后，进行液相色谱分析。在提取方法优化中，选择黄烷酮糖苷类化合物柚皮苷为代表，以及多甲氧基黄酮类化合物蜜橘黄酮为代表。以柚皮苷和蜜橘黄酮为例，在不同提取溶剂的情况下，柚皮苷和蜜橘黄酮提取含量的变化如图2所示。从图2可以看出，柚皮苷和蜜橘黄酮含量随提取溶剂中甲醇含量的增加先增大后减少，在50％甲醇含量的情况下，柑橘黄酮类化合物的提取含量最大。增加提取溶剂中甲醇的含量，有利于柑橘中柑橘黄酮类化合物的浸出；但提取溶剂中甲醇含量太高，柑橘黄酮类化合物的含量反而降低，其原因可能是甲醇的极性较大，反而不利于其浸出。因此，试验中采用甲醇含量为50％的提取溶剂。 2.2.2料液比的优化称取冷冻干燥粉碎后的果皮样品1g（精确至0.001g）6份，按照1∶10、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40和1∶50的料液比，分别加入10、20、25、30、40和50mL的50％甲醇-水溶液（体积比），超声提取30min；

取出于7 000r离心10min，上清液用超纯水稀释2倍后，进行液相色谱分析。以柚皮苷和蜜橘黄酮为例，在不同料液比的情况下，其含量变化如图3所示。从图3可以看出，柑橘黄酮类化合物的含量随料液比的增加而增加，但料液比大于25后，其含量变化不大。总体来看，增大料液比，提取效率有所增加，但提取液中柑橘黄酮类化合物的浓度变低，考虑到西柚中某些柑橘黄酮类化合物的含量较低，提取液浓度太低，不利于其测定。因此，试验中采用1∶25的料液比。

2.2.3提取时间的优化称取冷冻干燥粉碎后的果皮样品1g（精确至0.001g）6份，按照1∶25的料液比，加入25mL 50％的甲醇-水溶液，分别超声5、10、20、30、45和60min；取出于7 000r离心10min，上清液用超纯水稀释2倍后，进行液相色谱分析。以柚皮苷和蜜橘黄酮为例，其含量变化如图4所示。从图4可以看出，超声时间小于20min，各种柑橘黄酮类化合物的变化差异较大，超声30min后，其提取效率趋于一致，因此，试验中选择超声30min。

2.2.4提取次数的优化称取冷冻干燥粉碎后的果皮样品1g（精确至0.001g），按照1∶25的料液比，加入25mL 50％的甲醇-水溶液，超声提取30min，取出于7 000r离心10min，倒出上清液；残渣再加入25mL 50％的甲醇-水溶液分别提取3次。对每次提取离心后的上清液，用超纯水稀释2倍后进行液相色谱分析。以柚皮苷和蜜橘黄酮为例，其提取效率如图5所示。从图5可以看出，柑橘黄酮类化合物的含量随提取次数的增加而增加，提取2次后，提取回收率大于95％，提取3次后，提取回收率大于99％，试验中选择提取2次。

2.3线性关系、线性范围和检出限对1.2.1节配制的标准工作溶液，按照1.2.3节的色谱方法进行分析，以标准品的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归。以标准曲线的最低点为最低定量浓度，以3倍信噪比（S/N）计算检出限。各柑橘黄酮类化合物的回归方程、线性范围、相关系数和检出限如表1所示，结果表明各柑橘黄酮类化合物在给定浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）大于

0.99，方法的检出限小于1μg/mL。

2.4方法精密度对1.2.1节配制的10种柑橘黄酮类化合物的储备液，用甲醇和水进行稀释，配制浓度均为25.0和150μg/mL的混合质量控制溶液，按照1.2.3节的色谱方法进行分析，重复进样5针，考察各柑橘黄酮类化合物峰面积的变化。对25.0μg/mL和150μg/mL两种不同浓度的混合质量控制溶液，10种柑橘黄酮类化合物测定结果的相对标准偏差（RSD）均小于5.4％和3.9％，表明方法的精密度良好。

2.5方法重现性以西柚果皮为例，称取5份样品，按照1.2.2节的提取方法，独立进行提取和分析，考察各柑橘黄酮类化合物峰面积的变化。对10种柑橘黄酮类化合物，测定结果的相对标准偏差（RSD）均小于7.1％，表明方法的重现性良好。 2.6样品的测定对1.2.2节制备的西柚果皮、囊衣和果瓣冷冻干燥样品，每个样品独立提取3次，按照1.2.3节的色谱方法进行分析，其色谱如图6所示。 按照2.3节所述方法进行外标法定量分析，对西柚果皮、囊衣和果瓣等不同组织，柑橘黄酮类化合物的含量按照公式1进行计算。

式中：C表示西柚各组织中柑橘黄酮类化合物的含量（mg/kg），C'表示由标准曲线读出的含量（μg/mL），V表示样品提取的总体积（mL），D表示进样前的稀释倍数，m表示样品的称取质量（g）。

西柚冷冻干燥果皮、囊衣和果瓣中柑橘黄酮类化合物的含量测定结果如表2所示。从表2可以看出，西柚各组织的冻干产品，囊衣中的总黄酮（10种柑橘黄酮的总量）含量最高，达73.8mg/kg，其次是果皮，总黄酮含量为61.6mg/kg，果瓣中总黄酮含量最低，为6.57mg/kg。在总黄酮含量的比例中，三种组织中柚皮芸香苷和柚皮苷的含量最高，所占比例大体一致，为87.4％～89.0％。在果皮、囊衣和果瓣中，柚皮苷的含量比例递减，分别为80.7％、75.0％和61.2％；而柚皮芸香苷的含量比例递增，分别为8.5％、12.7％和26.3％，其中果瓣中柚皮芸香苷的

含量分别是囊衣和果皮的2倍和3倍。枸橘苷的含量仅次于柚皮芸香苷，在果皮、囊衣和果瓣中其占总黄酮的比例分别为7.2％、9.1％和4.0％。橙皮苷和新橙皮苷的含量在三种组织中的含量为0.5％～3.4％，其中果瓣中橙皮苷和新橙皮苷的含量较果皮和囊衣中的含量多5～7倍。三种甲氧基黄酮的含量之和均小于0.5％，其中囊衣中含量最低，接近于0。

通过上述分析可以看出，西柚的不同组织如果皮、囊衣和果瓣，其中柑橘黄酮类化合物的含量和分布差异显著，如图7所示。

西柚鲜果中果皮约占总重的21.4％，囊衣约占8.1％，果瓣约占70.5％；对各组织冷冻干燥后，果皮失重62.2％，囊衣失重70.0％，果瓣失重92.3％。通过表2的分析可以看出，柑橘黄酮在冻干后西柚不同组织如果皮、囊衣和果瓣中的含量及其分布，由于各组织在鲜果中重量的不同和含水量的不同，柑橘黄酮类化合物在鲜果中的分布表现出另外的特点，如图8所示。

比较图7和图8可以看出，在西柚不同组织的冻干产品中，果皮、囊衣和果瓣中柑橘黄酮类化合物的总量分别占西柚总黄酮含量的43.4％、52.0％和4.6％；而在鲜果中，果皮、囊衣和果瓣中柑橘黄酮类化合物的总量分别占西柚总黄酮含量的74.2％、20.4％和5.3％。由于果皮和囊衣含水量相近，而果皮比囊衣所占西柚总质量的比重较大，导致鲜果中果皮所含黄酮的总量占比加大，从43.4％上升至74.2％，相反，囊衣所含黄酮的总量从52.0％下降至20.4％。对总黄酮中含量较高的柚皮芸香苷和柚皮苷来讲，有相同的变化趋势。果瓣为西柚鲜果的可食部分，其中柑橘黄酮的含量约占西柚鲜果总黄酮含量的5.3％，西柚中大部分的柑橘黄酮存在于果皮和囊衣中。另外，西柚不同组织中所含柚皮芸香苷和柚皮苷的含量差异巨大，果瓣中含有较多的柚皮芸香苷，在柑橘类水果中呈现出西柚独特的口感和风味。

本文建立了西柚不同组织中10种柑橘黄酮类化合物的测定方法，通过色谱分离条

件的优化，各组分取得了良好的分离度，该方法提取效率高、线性关系好、检出限低、精密度高。该方法用于西柚不同组织中柑橘黄酮类化合物含量的测定，结果显示西柚果皮、囊衣和果瓣中柑橘黄酮类化合物的含量和分布特征差异显著。所建立的方法对西柚加工副产物的综合利用，西柚产品的基础营养、保健和药理研究，以及柑橘黄酮类化合物标准品的纯化制备等具有重要的意义。

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