第一节 种子制备

• 第四章 种子制备与菌种保藏

• 第一节 种子制备（Inoculum development）

定义：由保藏的菌种开始，经过逐级扩大培养，最后获得供生产车间发酵罐接种的的足够数量和优质质量的种子。

生产菌种的必备条件： 1 生长快： 2 对环境条件要有比较大的承受能力 3 遗传表现型要稳定，不易退化 4 菌种要纯

几个概念

种子罐级数：种子在种子罐中需扩大培养的次数。

发酵级数：种子罐的级数加一。

接种量：放罐的种子罐的培养液体积除以接种后培养液的体积的百分数。

种龄：生产种子的培养时间。

一 斜面种子的制备

1.斜面种子：在试管或扁瓶内，以琼脂固化的培养基表面上生长的菌种培养物。

2. 制备流程：

3. 制备过程注意事项 (1) 琼脂要完全浸没在营养液内,用量1.0%-2.5% ( 2) 营养液中最好不含易沉淀的固形物； (3) 装量掌握在斜面顶端不超过试管或扁平长度的2/3； (4) 灭菌后垂直放置至稍冷后再斜放，以减少冷凝水 (5) 微量元素先配制成一定的溶液，用移液管定量加入

3. 质量检查 (1) 外观检查 ( 2) 无菌检查 ( 3)摇瓶生产能力检查

4.影响斜面种子质量的因素 (1)原材料质量，水质，培养基pH， (2)灭菌条件， (3)接种量， (4)培养室温度、湿度、通风、 (5)培养时间， (6)有害气体或挥发物（培养室内不要安紫外灯） (7) 冷藏条件

• 二 、米粒种子（米孢子）

• 1. 米孢子：将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一段时间后产生的分生孢子。

• 2 . 米孢子制备工艺流程

• 3. 制备过程注意事项 （1）浸泡时间及加营养液量应掌握在灭菌后米粒熟透但不粘连； （2）分装量应掌握在平铺后有2-3粒米的厚度 （3）米粒不要碰到瓶塞； （4）培养前期应经常摇动米粒，使微生物在米粒表面生长均匀，气生菌丝及孢子长成后不再摇动。 （5）保存：冰箱保存；真空干燥保存；10%-20%甘油浸泡保存

• 4. 质量标准

• （1）无杂菌污染 （2）孢子数足够，发芽率高 （3）生产能力高 (4) 真空干燥

后含水量小于8% 5. 影响质量的因素及控制（同前）

• 三、种曲（培养材料用麸皮、米糠等，其余同米粒种子）

• 四、摇瓶种子 1.摇瓶种子 : 将斜面种子或米孢子接种于锥形摇瓶内的液体培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子。 2.制备流程 : 3.制备过程注意事项

• 培养基营养成分含量应较斜面丰富，以确保一定的营养菌体生长量；能保持生长过程中pH稳定。

• 培养基装量适当，以保证良好的通气并与发酵罐通气条件相适应；参考装量为40-50 ml/ 250 ml瓶，60-80 ml/ 500 ml瓶，90-110 ml/ 750 ml瓶，120-150 ml/ 1000 ml瓶；如果是厌氧培养，则装量应增加一倍以上； 3) 灭菌时要注意不要让蒸汽冷凝水打湿或粘污培养基在瓶塞或纱布上 4） 注意摇床转速，转速越快，偏心距越大，通气越好。经常检查，皮带松弛时要紧一紧。 5） 注意摇床中心与边缘、上层与下层的温差

3.质量检查： ( 1) 菌体浓度：外观稠度，静置沉降率，离心沉降率。 ( 2) 菌体生长阶段：显微镜检查细胞分化情况。 ( 3) 代谢情况：对残余糖、氮进行化学分析，并测量pH值。 ( 4) 生产能力：摇瓶发酵试验。 ( 5) 污染杂菌情况：镜检及无菌试验检查 4. 影响质量的因素

五、发酵罐种子 1.制备流程 ： 斜面、摇瓶或米粒种子 ↓ 培养基配制 → 实罐或连续灭菌 → 冷却 → 火圈或压力差接种 →培养→ 发酵罐种子

• 2 .制备过程注意事项

• 培养基要求与发酵培养基大致相同，较摇瓶培养基丰富， 控制培养基成份的合理配比， 2) 接种方式： 一级种子罐：火圈保护接种法和压差法二级种子罐：压差法3）通气培养时通入空气的温度适中（20-50℃），搅拌转速也要适当。 4）采用夹套或蛇管冷却以保持恒温，温度不能高于控制温度，防止造成异常发酵 5） 通过培养基中生理酸碱性物质的配比，使pH自然维持在适宜的范围 6）控制合适移种量： 确定合适的移种量：过大或过小都对发酵有不利影响 掌握种子罐的放罐体积。 移种方式：

• 3.质量检查及质量标准： 1）不污染杂菌 2）菌体生长阶段（种龄）：处于对数生长期后期， 菌体量未达到高峰3）菌体浓度： 菌体浓度的测定方法：离心沉淀法、光密度法、细胞记数法等 4）糖、氮、磷代谢情况 5）种子液pH 6）摇瓶试验的发酵水平 7）特异性酶活力

• 4 影响质量的因素

• 5 种子代谢缓慢原因分析 空气温度偏低 局部烫伤 培养基原材料质量差 培养基灭菌温度太高，营养成分破坏多 无机磷量低 接种量太小 前一级种子质量太差 泡沫多通气差

• 第二节菌种保藏 （strain conservation)

• 定义： 将有用的微生物以特定培养形态在特定的环境条件下存放，以保持种的存活、纯粹和遗传性状的稳定。

• 一、条件及原理

• 1. 低营养

• 2. 干燥

• 3. 隔氧

• 4. 低温 降低代谢速率或使细胞处于休眠状态

• 5. 密封 保持干燥、隔氧、纯粹

• 二、常用的菌种保藏方法 1 单纯传代保存法（斜面或穿刺）4℃冰箱或15℃室温，保存期3-6个月 适用于细菌或酵母

• 2 结合单孢子分离的传代保存法 斜面→孢子悬浮液→稀释涂布→单细胞分离培养 →挑菌→高产菌株的筛选→高产菌株的保藏 4℃冰箱或15℃室温，3-6个月 适用于遗传不稳定的菌种,既保藏了菌种，又保持了生产能力

• 3 米孢子保存 密封，4℃冰箱3-6个月；真空抽干后密封，保藏6-12个月。 适用于霉菌的保藏

• 4 庭院土保藏法 灭菌庭院土为保藏介质，培养，真空干燥，密封 4℃冰箱一年以上保存期 适用于霉菌、放线菌和形成芽孢的细菌的保藏

• 5 沙土管保存 过筛、灭菌并干燥的沙土为保藏介质，接种， 真空干燥、密封，4℃冰箱保存，1-3年保存期。 适用于霉菌、放线菌和形成芽孢的细菌的保藏

• 6 孢子或营养细胞悬浮液保存 悬浮于灭菌的10%-20%甘油介质， 低温冰箱（-50- -70℃）1-2年

• 7 冷冻干燥管保存（lyophilization freeze-drying )

• 收集菌种 灭菌脱脂牛奶或马血清作为悬浮介质

• 灭菌安瓿管 预冻 真空冻干 密封，

• 4℃冰箱，保存3-5年

• 适用于一切微生物的保存

• 细胞 10%-20%甘油作为悬浮介质

• 分装入无菌聚丙烯管 预冻 置液氮内（-196℃），

• 保存5-10年

• 适用于所有微生物、动物和植物细胞的保存

• 8 液氮管保存 (storage in liquid nitrogen)

• 9、基因工程菌的保藏

• 由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复

制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。

• 一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。

• 当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。

• 我们建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。

第三章 灭菌(sterilization)

灭菌：指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。

第一节 灭菌的原理及方法

一 几种常见的灭菌方法 1 化学物质灭菌 原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使蛋白质变 性酶失活。 常用的灭菌剂:使用范围： 器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌， 不能用于培养基灭菌

2. 辐射灭菌

原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。

常用：紫外线、X射线和γ射线。

• 使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌

• 3．干热灭菌

• 原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。

• 常用方法：灼烧和电热箱加热，140-180℃ 1-2小时

• 使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌

• 4．湿热灭菌

• 原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。

• 常用方法： 水煮常压灭菌：100℃ 饱和蒸汽灭菌：一般121℃，30分钟

• 使用范围：培养基和发酵设备灭菌。

• 5．过滤除菌

• 原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。

• 方法: 0.01~0.45 m孔径滤膜，

• 使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。

• 二. 湿热灭菌原理

• 1.生物热死动力学（对数残存定律） dN / dt =- K N N：菌体个数（个） t : 灭菌时间（min） k：反应速度常数（min-1） dN / dt: 菌受热死亡速率(个/min) Ln N/

N0 = - K t N= N0 e- K t 以菌的残留数Ln N/ N0的对数与时间t 作图，得出一条直线，

其斜率为- K （P222 图14-1）

• 如何通过实验根据对数残存定律确定某一温度,某一微生物的K ？ 1). K 与菌种的特性有关 相同温度下，微生物越耐热， k值越小。 相同温度下，微生物越不耐热，k值越大。

• 2 .反应速率常数K • 2). K 与灭菌温度有关 K=A e –E / RT （阿累尼乌斯方程） Ln K =Ln A- E/ RT A：比例常数 R：气体常数(J/ mol K) T：绝对温度( K) △E：杀死细菌所需的活化能（J/ mol） • 第二节 培养基和发酵设备的灭菌工艺 • 一．培养基灭菌时间的选择 t =1/ k * Ln( N0/ N) 其中 K：一般耐热的细菌芽孢的K值 N0 ：细菌及芽孢数之和 N：10 -3 • 二. 培养基灭菌温度的选择 • 选择即能达到灭菌要求，又保证营养成分不被破坏的温度 1.培养基营养成分破坏动力学方程 -dC/dt = K’ C -dC/dt :营养物降解速度

mol /( L h) C: 营养物浓度 mol / L K’ : 营养物降解反应速度常数 1 / s t ：时间( S )

• Ln (C/ C0 ) = - K ‘ tK’ = A’ e- E’/ RT Ln K’ =Ln A’- E’/ RTA’：比例常数 R：气体常数(J/ mol K) T：绝对温度( K) E’：营养物破坏所需的活化能（J/ mol）

• 2.根据实验结果灭菌活化能大于培养基破坏活化能 E＞ E’ P225 表14-11 3. 灭菌反应

营养物破坏反应 T1 Ln K1 =Ln A- E/ RT1

Ln K1’ =Ln A’- E’/ RT1

T2 Ln K2 =Ln A- E/ RT2 Ln K2’ =Ln A’- E’/ RT2 Ln ( K2/ K1) = E/ R(1/ T1-

1/ T2 ) Ln ( K2’ / K1’ )= E’/ R(1/T1- 1/T2) Ln( K2/ K1) = E Ln ( K2’ / K1’ ) E’ Ln ( K2 / K1) ＞ Ln ( K2’ / K1’ ) K2 / K1 ＞ K2’ / K1’ 当温度升高时微生物死亡速度常数比营养物质降解速度常数变化得大

• 4．达到相同灭菌效果，T越高，K越大，所需t 越短，采用高温短时（HTST）灭菌效果好

• 三 影响灭菌效果的因素

• 微生物种类：不同的微生物k值不同。

• 初始菌量：在保持N值不变的前提下，t 与初始菌量N0的对数成正比。

• 培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性。

• 传热与混合状况：影响受热均匀度。

• 培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。

• 蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。

• pH：酸性pH下可加快微生物热死速率

• 四. 培养基和发酵设备的灭菌方法

• （一）实验室种子培养基灭菌方法 使用高压蒸汽灭菌锅 手提式灭菌锅。容量小。 立式或卧式灭菌锅。容量较大， 一般能装几十瓶或几百瓶。 灭菌柜。要和蒸汽锅炉配套， 用于大量种瓶培养基的灭菌， 一次能装几百至几千瓶(袋)。

• 四. 培养基和发酵设备的灭菌方法

• （二）分批灭菌(batch sterilization)

• 1．定义： 将配制好的培养基输入发酵罐中，用蒸汽加热，使培养基和设备同时灭菌的一种灭菌方式。

• 2．操作过程：空罐准备：清洗、检修和检测。 升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。 冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度。

• 三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。

• *

• 四路出汽：直接蒸汽从排气、接种、进料和消沫剂管排气

• 分批灭菌设备示意图

• 三）连续灭菌(continuous sterilization) 1．定义：将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式。 2．流程： 1)由热交换器组成的灭菌系统 2)蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统 3）由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统

• 三）连续灭菌与分批灭菌的比较与选择

• 分批灭菌

• 优点：

• 1．不需附加设备

• 2． 蒸汽利用率高

• 3． 节约劳动力

• 缺点

• 1． 培养基质量比较差

• 2． 罐的利用率低

• 3. 冷却水用量大

• 连续灭菌

• 优点：

• 1 采用高温快速灭菌法

• 2．可以把培养基按其性质分开灭菌

• 3． 有利于自动控制

• 4． 节省冷却水

• 缺点

• 1． 投资费用高

• 2． 对物料要求高

• 3． 蒸汽用量大

• 选择原则： 1． 培养基成份（易降解成分、液化情况等）积、传动装置等） 3. 动力条件

2． 设备状况（冷却面

• 消除高温有害影响的措施

• （1）采用特殊加热灭菌法(连续灭菌方法）

• （2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；

• （3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；

• （4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌

• 第三节 空气除菌

• 一、无菌空气的要求

• 1 .空气中的微生物

• 空气中的微生物种类以细菌和细菌芽孢较多，也有酵母，霉菌孢子和病毒。

• 这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为103~104个／米3。

• 灰尘粒子的平均大小约0.6μm左右，所以空气除菌主要是去除空气中的微粒(0.6-1μm ）

• 一、无菌空气的要求

• 无菌空气的标准 百分数：99.99％ 美国联邦宇航局等级标准： 100级（直径小于0.5微米粒子数少于3.5个/L） 温度：25 ℃—40℃ 湿度：30%—45%

• 1. 纤维或颗粒介质填充床过滤器：棉花、玻璃纤维、腈纶、涤纶、维尼纶或活性炭等 2.折叠式硼硅酸超细纤维过滤器：超细玻璃纤维 3.烧结金属、陶瓷过滤器

• 二 介质除菌：

• 原理：过滤介质填充到过滤器中，空气流过时借助惯性碰撞、阻截、扩散、静电吸附、沉降等作用将尘埃微生物截留在介质中，达到除菌的目的。

• 主要设备：填充床过滤器

• 发酵生产中制备无菌空气的大致过程

• 空气介质除菌流程

• 高空取气管是远离地面几十米的管子。一般而言，地面附近空气中所含的 微生物和灰尘等均比高空空气中含的多，据资料介绍，每升高10米，空气中杂菌可降低一个数量级，因此从高空取气要比从低空取气有利得多。

• 三 膜过滤（绝对过滤） 原理：利用微孔滤膜（microporous membrane）对空气进行过滤，膜的孔径0.2-0.45微米，大于这一孔径的微生物能绝对截留。 膜过滤器 ：聚四氟乙烯、偏聚二氟乙烯、、聚丙烯、纤维素脂膜等