HHH农杆菌介导的禾谷镰刀菌的遗传转化及转化子性质的初步研究

刘海青

【摘要】：禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw.)引起麦类作物的赤霉病。了解F.graminearum致病性的分子机理对赤霉病的防治和抗病品种的选育等具有重要意义。为了阐明F.graminearum的致病性机理,我们采用农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)构建T-DNA插入突变体库,从中筛选致病性突变体,并研究相应基因在其致病性中的作用。本研究分析影响禾谷镰刀菌的ATMT转化的各种因素,初步构建了转化库,并筛选到了菌落形态、显微特征变异较大和致病性发生改变的转化子,主要研究结果如下: 1.对影响ATMT转化率的一些因素进行了优化,这些因素包括:筛选培养基种类、禾谷镰刀菌孢子浓度、诱导剂乙酰丁香酮AS浓度、共培养时间、共培养基pH值、根癌农杆菌浓度、用于转化的禾谷镰刀菌孢子新鲜度。通过优化建立了农杆菌的高效转化体系为:将收集到的禾谷镰刀菌孢子,孢子浓度为10~6个/mL,诱导剂AS的浓度为75μmol/L,根癌农杆菌的浓度OD_(600)为0.12—0.15,根癌农杆菌和禾谷镰刀菌孢子于25℃在共培养基(pH为5.3)共培养24hr,再转移到筛选培养基上筛选。采用这样的转化体系可以得到100-200个转化子/10~6个孢子。 2.随机挑取10个转化子,提取DNA,根据转化质粒上已知GUS基因序列设计引物,进行PCR。结果证明转化子含有插入的T-DNA片段。 3.对转化子的遗传稳定性进行了分析。随机挑选10个转化子,在PDA和含75μg/mL潮霉素的PDA上分别转代4次观察菌落形态,并观察GFP荧光。结果转化子都能在含潮霉素的培养基上生长,并能观察到荧光,说明转化子在遗传上是稳定的。 4.将转化子接种于PDA上,25℃培养5-14d,观察并筛选菌落形态和显微特征变异明显的转化子。结果发现绝大部分转化子的菌落形态与原始菌株相同,只有少部分转化子的菌落形态有明显差异。其中对照的菌落是淡红色的,而转化子中有些则是变异成为红黄相间,如1-34,1-43,1-57,1-170;有的则变成淡黄色,如1-56,1-35;还有的是深红色,如1-50,1-111,1-138,1-160。同时也发现,

转化子1-165的菌丝的生长速度明显减慢。在观察孢子形态的时候发现,有几个突变菌株容易观察到小孢子,如:1-23,1-32,1-101,1-103,1-113,1-116。 5.转化子致病性测定,采用大麦麦穗注射接种法和小穗单花滴注接种法,结果发现:1-5,1-11,1-27,2-5等4个转化子的菌株接种后,发病程度比野生型菌株要轻,说明这些转化子减少了致病性。 目前我们正在对初步筛选获得的禾谷镰刀菌生长减慢、丧失致病性转化子进行进一步的鉴定,并运用TAIL-PCR分离克隆T-DNA插入区域的侧翼序列。 本研究建立的农杆菌介导转化禾谷镰刀菌体系,为进一步构建大库容量的T-DNA插入突变体库、致病性突变体筛选以及致病性相关基因的克隆鉴定奠定了基础。

【关键词】：禾谷镰刀菌农杆菌介导遗传转化插入突变致病性突变体

【学位授予单位】：浙江大学

【学位级别】：硕士

【学位授予年份】：2006

【分类号】：S435.121.45

【目录】：

摘要6-7

Abstract7-9

一 文献综述9-16

1. 禾谷镰刀菌及其致病性9-11

1.1 麦类赤霉病9

1.2 禾谷镰刀菌分泌的与致病性有关的物质9-10

1.3 禾谷镰刀菌致病性的分子机理10-11

2. 农杆菌介导的丝状真菌的遗传转化11-15

2.1 影响ATMT转化的因素12-13

2.3 根癌农杆菌介导的丝状真菌转化的特点13-15

3. 本研究的目的15-16

二 材料与方法16-19

2.1 供试菌种16

2.2 转化质粒16

2.2 培养基的配制16

2.3 方法16-17

2.3.1 禾谷镰刀菌孢子的制备16

2.3.2 根癌农杆菌的活化及诱导培养16-17

2.3.3 禾谷镰刀菌孢子与根癌农杆菌的共培养和转化子的筛选17

2.4 转化率影响因素的研究17-18

2.4.1 筛选培养基对转化率的影响17

2.4.2 禾谷镰刀菌孢子浓度对转化率的影响17

2.4.3 诱导剂乙酰丁香酮AS浓度对转化率的影响17

2.4.4 共培养时间对转化率的影响17

2.4.5 共培养基pH值对转化率的影响17

2.4.6 根癌农杆菌浓度对转化率的影响17

2.4.7 用于转化的禾谷镰刀菌孢子新鲜度的影响17-18

2.5 抗生素对供试菌株的影响18

2.7 转化子DNA提取与分析18-19

2.7.1 CTAB法提取基因组DNA18

2.7.2 PCR验证18-19

2.8 转化子遗传稳定性分析19

2.9 转化子的表型分析19

2.10 致病性测定19

三 结果与分析19-27

3.1 ATMA转化条件的优化19-23

3.1.1 筛选培养基的优化19-20

3.1.2 禾谷镰刀菌孢子浓度的优化20

3.1.3 AS浓度对转化率的影响20-21

3.1.4 共培养时间对转化率的影响21

3.1.5 培养基的pH值对转化效率21-22

3.1.6 根癌农杆菌浓度对转化率的影响22-23

3.1.7 用于转化的禾谷镰刀菌孢子新鲜度的筛选23

3.1.8 转化后的高效转化体系和转化库的构建23

3.2 抗生素对真菌的影响及其适宜的使用浓度23-24

3.2.1 潮霉素B对禾谷镰刀菌孢子萌发和菌丝生长的影响23-24

3.2.2 头孢霉素和壮观霉素的合适用量24

3.3 转化子的检测24-27

3.3.1 转化子插入稳定性检测24

3.3.2 PCR检测24-25

3.3.3 转化子的表型分析25

3.3.4 转化子的致病性测定结果25-27

四讨论27-34

参考文献34-40

致谢