细胞鉴定

成骨细胞鉴定：

1. Giemsa染色：

将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 L-1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa染液染2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。

2. 碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：

细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min，按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。核固红复染细胞核，自然干燥后中性树胶封固。阳性细胞可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位。

3. 钙化结节染色(茜素红法)：

细胞接种方法同上，弃培养基，培养板用PBS冲洗2次，体积分数95%乙醇固定30 min，蒸馏水冲洗3次，0.1%茜素红[茜素红-Tris-Hcl(pH 8.3)]染色，37 ℃，30 min，蒸馏水冲洗。低倍镜视野(×40)下进行矿化结节观察。

4. Von Kossa’s矿化结节染色法：

细胞接种方法同上，弃培养基，培养板用PBS冲洗2次，40 g/L多聚甲醛固定标本，5%硫代硫酸钠孵育30 min，蒸馏水冲洗，然后用1%硝酸银溶液紫外线下染色30 min，蒸馏水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质，继续用5%硫代硫酸钠染色2 min，1%中性红复染10 min，蒸馏水漂洗后观察。

5. 成骨细胞扫描电镜表面形态观察：

培养24 h后取出预先置培养板内的圆盖玻片( 直径9 mm)，用PBS冲洗3次，加入3%戊二醛固定2 h；用PBS冲洗3次，45 min/次。加入1%锇酸，固定2 h。体积分数为50%，70%，80%，90%，95%的乙醇逐级脱水，各15 min；体积分数100%乙醇脱水2次(15 min/次)。醋酸异戊酯15 min。CO2临界点干燥，黏附于载物台上真空镀膜仪镀金，扫描电镜观察并摄片。

6. 成骨细胞透射电镜超微结构观察：

消化收集细胞，1 000 r/min离心5 min弃上清；前固定：加入预冷的固定液3%戊二醛固定2 h。漂洗：弃戊二醛，将细胞团块挑出，包入擦镜纸内， 装入小瓶中，加入PBS过夜。去除液体，PBS漂洗，重复3次(每隔15 min 1次)。后固定：清洗后，加入1%锇酸固定3 h。漂洗：弃去锇酸，加入0.1 mol/L的PBS漂洗，步骤同上。乙醇逐级脱水，丙酮浸透。包埋，修块，切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染，透射电镜观察并摄片。

7. 生长曲线测定：

将生长状态良好的SD乳鼠成骨细胞传至96孔培养板，接种密度5×103/孔，将培养板移入CO2孵箱中，在37 ℃、体积分数5% CO2及饱和湿度条件下培养。每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37℃孵箱中继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。

8. 主要观察指标：

主要观察成骨细胞的形态、试剂及仪器 来源H-DMEM 培养基、胎牛血清胰蛋白酶、青霉素、链霉素、Ⅱ型胶原酶H-500 型透射电子显微镜JSW-T300 扫描电镜SW-CJ 型生物洁净工作台CO2 培养箱倒置相差显微镜。大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定成骨细胞特征性染色、超微结构及生长曲线。

破骨细胞鉴定：

1. 形态观察: 破骨细胞含多个核,经 HE、 Giemsa染色光镜观察一般含 5～20 个核;噬骨实验即骨片上形成骨吸收陷窝是破骨细胞鉴定的重要标准, 因为与破骨细胞类似的巨噬细胞无此功能, 骨片的制备可利用新鲜牛股骨皮质骨, 用金刚砂片切割成薄片, 再用金刚砂石和磨玻璃磨成约 10 m 厚、 6mm×6mm 薄片, 经超声波清洗后置 199 培养液中浸泡待用。骨吸收陷窝观察被用来评价体外培养破骨细胞骨吸收功能, 以往多在扫描电镜下进行陷窝计数,采用 1%甲苯胺蓝染色, 利用骨吸收陷窝计数光镜法和计算机图象分析系统,可较为全面评价骨吸收功能, 计数结果与电镜法具有良好的相关性;

2. 抗酒石酸酸性磷酸酶( TRAP) 染色: 抗酒石酸酸性磷酸酶为破骨细

胞胞浆中所特有酸性磷酸酶, 具体方法是: 将细胞爬片置于

37℃烘箱中烘 5min, 用 2. 5%体积分数的戊二醛 4℃固定

10min, 同时温育孵育液( 六偶氮副品红 0. 2ml, 0. 1m ol/ L 醋

酸钠缓冲液 38ml, 2ml 奈酚 AS- BI 磷酸盐溶液, 0. 388g 酒石

酸钾钠, pH 5. 0)至 37℃,双蒸水洗 3 次,苏木素复染,二甲苯

透明, DPX 封固, 光镜观察

3. T rAT Pase 染 色: 反 应较TRAP 染色的特异性更高, 胞浆呈棕黑色颗粒状

4. 降钙素受体检测: 破骨细胞膜含有丰富的降钙素受体, 对降钙素应

答反应呈兰紫色

成纤维细胞鉴定：

1 形态学鉴定 倒置显微镜下观察细胞由组织块边缘游出的情况 观察细胞形态及传代后细胞生长状况。

2 免疫学鉴定 细胞传至 4 代 制成 1X 105/cm2的细胞悬液 制备细胞爬片 按免疫组化试剂盒说明书及 DAB 显色步骤 分别进行抗波形丝蛋白抗体 抗角蛋白抗体染色 以磷酸盐缓冲液 PBS 代替抗体作为阴性对照组 光镜下观察染色结果。