国际检验医学杂志２０１５年１月第３６卷第１期Ｉｎｔ Ｊ ＬａｂＭｅｄ，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１５，Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．１ ・ ５７ ・ ・论 著・ 血浆ｍｉｃｒｏＲＮＡ实时荧光定量ＰＣＲ检测方法的建立 李静，谭彩虹△ （湖北文理学院医学院附属谷城县人民医院检验科，湖北襄阳４４１７００） 摘 要：目的 建立特异、稳定且可靠的血浆ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡｓ）实时荧光定量ＰＣＲ技术。方法 收集１Ｏ例健康人血浆 标本，采用ｍｉｒＶａｎａＴＭ ＰＡＲＩＳ ｋｉｔ试剂盒法提取血浆ｍｉＲＮＡｓ，以ｍｉＲＮＡ特异的茎环引物引导逆转录，通过ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ实时荧 光定量聚合酶链反应（ＰＣＲ）对外参照ｃｅ１一ｍｉＲ＿３９、ｅｅｌ—ｍｉＲ一２３８及血浆ｍｉＲ－３４２—３ｐ进行检测。结果健康人血浆ｍｉＲ一３４２—３Ｐ及外 参ｃｅｌ—ｍｉＲ－３９、ｃｅｌ－ｍｉＲ－２３８可以实现特异性扩增及定量。溶解曲线显示１Ｏ例健康人血浆标本中ｃｅｌ—ｍｉＲ－３９、ｃｅｌ－ｍｉＲ一２３８和ｍｉＲ一 ３４２—３ｐ扩增产物分别在８１．４４、８Ｉ．６２、８２．７１℃时出现单一峰，无引物二聚体峰和其他非特异峰出现。血浆ｍｉＲ－３４２—３ｐ批内批间 重复性实验的标准差在０．Ｉ３～０．２０、变异系数（ＣＶ）在０．４２ ～０．６６ ，显示该方法重复性较好。以ｃｅｌ—ｍｉＲ一３９、ｃｅｌ—ｍｉＲ－２３８作 为外参照，同一血浆标本ｍｉＲ－３４２－３ｐ的５次检测结果ＡＣｔ的标准差为０．２２、ＣＶ为１．６８ ，说明ｃｅｌ—ｍｉＲ０—３９、ｃｅｌ—ｍｉＲ一２３８可作为 血浆ｍｉＲＮＡｓ实时荧光定量ＰＣＲ检测的稳定外参。结论 实时荧光定量ＰＣＲ技术可作为研究血浆ｍｉＲＮＡｓ较好的技术平台。 关键词：实时荧光定量； 血浆ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ； 外参照 ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４１３０．２０１５．０１．０２４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３—４１３０（２０１５）０Ｉ－００５７－０３ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｐｌａｓｍａ ｍｉＲＮＡ Ｌｉ Ｊｉｎｇ，Ｔａｎ Ｃａｉｈｏｎｇ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｇｕｃｈｅｎｇ Ｃｏｕｎｔｒｙ Ｐｅｏｐｌｅ ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｈｕｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｔｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｘｉａｎｇｙａｎｇ，Ｈｕｂｅｉ ４４１７００ Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｌａｓｍａ ｍｉ— ｃｒｏＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ １０ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ，ａｎｄ ｍｉＲＮＡｓ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｍｉｒＶａｎａＴＭ ＰＡＲＩＳ ｋｉｔ．Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｃｅｌ—ｍｉＲ－３９ ａｎｄ ｃｅｌ—ｍｉＲ－２３８ ａｎｄ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｌａｓｍａ ｍｉＲＮＡｓ ｗｅｒｅ ｒｅｖｅｒｓｅｌｙ ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｐｅ— ｃｉｆｉｃ ｓｔｅｍ—ｌｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｃｅｌ－ｍｉＲ一３９，ｃｅｌ－ｍｉＲ一２３８ ａｎｄ ｍｉＲ－３４２—３ｐ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｉｎ ＲＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍａ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａ— ｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｃｅｌ—ｍｉＲ一３９，ｃｅｌ—ｍｉＲ－２３８ ａｎｄ ｍｉＲ一３４２—３ｐ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｅａｋ ａｔ ８１．４４，８１．６２ ａｎｄ ８２．７１℃，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｒｉｍｅｒ ｄｉｍｅｒ ｐｅａｋ ｏｒ ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｅａｋ ｉｎ ａｌｌ １０ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｐｌａｓｍａ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ（ＳＤ）ｏｆ ｉｎｔｒａ－ａｓｓａｙ ａｎｄ ｅｘｔｒａ－ａｓｓａｙ ｏｆ ｍｉＲ－３４２—３ｐ ｗａｓ ０．１３—０．２０，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ（ＣＶ）ｗａｓ ０．４２ 一０．６６ ，ｗｈｉｃｈ ｓｕｇ— ｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ａ ｇｏｏｄ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｍｉＲ一３４２—３ ｐ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ａ ｓａｍｅ ｐｌａｓｍａ ｓａｍｐｌｅ，ｅａｃｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｏｒ ５ ｔｉｍｅｓ，ａｎｄ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｂｙ ｃｅｌ—ｍｉＲ－３９ ａｎｄ ｃｅｌ－ｍｉＲ－２３８．Ｔｈｅ ＳＤ ａｎｄ ＣＶ ｏｆ ＡＣｔ ｗａｓ ０．２２，１．６８ ，ｒｅ— ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｃｅｌ—ｍｉＲ－３９ ａｎｄ ｃｅｌ—ｍｉＲ一２３８ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｔａｋｅｎ ａｓ ｔｈｅ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｍｉＲ— ＮＡｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｃｏｕｌｄ ｓｅｒｖｅ ａｓ ａ ｇｏｏｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｐｌａｓｍａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ；ｐｌａｓｍａ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ； ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ）是一类长约１９～２３个核苷酸的内 源性非编码单链ＲＮＡ分子¨１］。过去一直认为ｍｉＲＮＡｓ可能 被细胞外大量存在的ＲＮＡ酶所降解，初期研究主要针对细胞 内ｍｉＲＮＡｓ。２００８年，中国学者张辰宇教授课题组以及美国 静脉血２ ｍＬ，以ＥＤＴＡ－Ｋ 抗凝，９６０ ｒ／ｒａｉｎ离心１０ ｍｉｎ，将上 清液移至１．５ ｍＬ ｆｒｅｅ—ＲＮａｓｅ的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，４℃１６ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｒａｉｎ，进一步去除残留的血细胞，血浆置于一８Ｏ ℃保存。 Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ肿瘤研究中心几乎同时报道ｍｉＲＮＡｓ可稳定 存在于血清／血浆中，并可作为肿瘤或其他疾病潜在的生物标 志物∞ ］。血清／血浆中ｍｉＲＮＡｓ的丰度较细胞中低，常规的 Ｔｒｉｚｏｌ法难以提取到较高浓度的ＲＮＡ。血清／血浆中缺乏稳 １．２仪器与试剂 ７５００型荧光定量ＰＣＲ仪（美国ＡＢＩ公 司），梯度ＰＣＲ仪（美国Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司），核酸／蛋白定量仪Ｂｉｏ— ｍａｔｅ ３（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司），高速冷冻离心机（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 公司），ｍｉｒＶａｎａＴＭ ＰＡＲＩＳ ｋｉｔ血浆ｍｉＲＮＡ提取试剂盒（美国 Ａｍｂｉｏｎ公司），反转录试剂（美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司），ｑＲＴ—ＰＣＲ试 剂盒（日本ＴａＫａＲａ公司），ｍｉＲＮＡｓ引物（中国ＲｉｂｏＢｉｏ公司）。 定的内参，这是血浆ｍｉＲＮＡｓ定量的又一大挑战。本研究旨 在建立一种试剂盒提取ＲＮＡ，以ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９和ｃｅｌ－ｍｉＲ－２３８为 外参照的血浆ｍｉＲＮＡｓ定量检测方法，为研究疾病相关循环 ｍｉＲＮＡｓ奠定技术平台。 １资料与方法 人工合成ｃｅｌ—ｍｉＲ－３９、ｃｅｌ－ｍｉＲ－２３８标准品（中国ＲｉｂｏＢｉｏ 公司）。 １．３血浆ＲＮＡ的提取 ２００ Ｌ血浆加入变性溶液混匀，冰 采集１Ｏ例谷城县人民医院健康体检者空腹 浴５ ｍｉｎ，分别加入１Ｏ Ｌ ２５ ｆｍｏｌ／／￣Ｌ的外参ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９和 １．１一般资料作者简介：李静，男，检验技师，主要从事自身免疫性疾病的研究。 通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｒａｉｎｂｏｗ＿ｔａｎ８９＠１２６．ｃｏｍ。 ・ ５８ ・ 国际检验医学杂志２０１５年１月第３６卷第１期Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１５，Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．１ ｅｅｌ—ｍｉＲ－２３８（终浓度为０．６１ ｆｍｏｌ／／，Ｉ ），加入４００ Ｉ 氯仿混匀 表１ ＲＮＡ样本编号 血浆ＲＮＡ提取液纯度及浓度鉴定 ＯＤ２６Ｏ／２８０比 浓度（ｎｇ／￣Ｌ） ５５．２Ｏ 冰浴５ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ低温离心１０ ｍｉｎ，吸取２００“Ｌ上清 液放过滤柱，加入２５０ Ｌ １００ 乙醇１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ，低温离心１ ｍｉｎ。弃上清液，加入７００“Ｌ ｗａｓｈｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ１，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ ７９．６０ 低温离心１ｒａｉｎ。弃上清液，加人５００“Ｌ ｗａｓｈｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２、３， １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ低温离心１ｒａｉｎ 重复１遍，弃上清液加入１００ Ｌ ９５℃预热的ＲＮａｓｅ—ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ低温离心１ ｍｉｎ，弃去过滤柱，ＲＮＡ溶液置冰上备用。 １．４ ＲＮＡ纯度及浓度测定 参照核酸／蛋白定量仪Ｂｉｏｍａｔｅ ３操作手册测定试剂盒抽提的ＲＮＡ纯度和浓度，其中纯度以 ＯＤ２６０／２８０表示，浓度按ＯＤ２６０／２８０×４０ ｎｇ／ｐｔＬ计算。 １．５荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ血浆ＲＮＡ逆转录体系为５ｏ Ｌ，包 括ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １５ Ｌ，ＲＮＡ溶液１５ Ｌ，ｍｉＲＮＡ特异性 逆转录引物４ Ｌ，５×Ｂｕｆｆｅｒ １０ Ｉ ，ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ ４ Ｌ，Ｍ— ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｅｒｉｐｔａｓｅ １ Ｌ，ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ Ｌ，反应 参数：４２ Ｃ ６０ ｍｉｎ，７０℃１０ ｍｉｎ，一４℃，ｅＤＮＡ置一２０。Ｃ备 用。ＰＣＲ体系为２０／，Ｌ，包括ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ５ⅡＬ，ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ９ ｔ＊Ｉ ，ｍｉＲＮＡ特异性前向引物２ Ｌ，ｍｉＲＮＡ后向通用 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １ 引物２ ｇＩ ，ｃＤＮＡ ２ Ｉ ，循环参数设定：９５℃２０ ｓ；９５℃１０ ｓ； ６Ｏ℃３４ ｓ；９５℃１５ ｓ；６０℃３０ ｓ；９５℃１５ ｓ，共４Ｏ个循环。以 不含ＲＮＡ模板的ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ作为阴性对照。每个样本 检测３个复孔，以线虫ｅｅｌ—ｍｉＲ－３９、ｃｅｌ—ｍｉＲ－２３８为外参照，以 ２ 。计算ｍｉＲＮＡ的相对表达量，其中ＡＣｔ—Ｃｔ ＮＡ一 （Ｃｔｃｅｌ－ｍ［Ｒ＿３９＋Ｃｔ ｌ一 Ｒ ２３８）／２。 １．６ ＲＴ—ｑＰＣＲ重复性试验因ｍｉＲ ３４２—３ｐ在血浆中的丰度 较高，故本实验选取ｍｉＲ一３４２—３ｐ进行批内重复及批间重复性 验证。批内重复性：ｍｉｉｒＶａｎａＴＭ ＰＡＲＩ；ｉＳ ｋｉｔ试剂盒法提取两 ｌ 份健康人血浆标本ＲＮＡ，弘 经ｍｉ∞ 蛆 Ｒ－３４２—３ｐ特异性茎环引物逆转 ∞ 订 录成ｅＤＮＡ后，ＲＴ—ｑＰＣＲ同批次进行５个平行孑Ｌ检测ｍｉＲ－ ３４２－３ｐ的表达水平，求ｍｉＲ一３４２—３ｐ Ｃｔ值的平均值、标准差、变 异系数（ＣＶ）。批间重复性：ｍｉｒＶａｎａＴＭ ＰＡＲＩＳ ｋｉｔ试剂盒法 提取两份健康人血浆标本ＲＮＡ，经ｍｉＲ一３４２—３ｐ特异性茎环引 物逆转录成ｅＤＮＡ后，ＲＴ—ｑＰＣＲ检测ｍｉＲ－３４２—３ｐ的表达水 平，１周重复检测５次，求ｍｉＲ－３４２—３ｐ Ｃｔ值的平均值、标准差、 Ｃ 。 １．７ ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９、ｃｅｌ－ｍｉＲ－２３８作为外参照的稳定性试验将 同一血浆标本分为５份，提取血浆ＲＮＡ之前依次加入等量的 人工合成的外参照ｃｅｔ—ｍｉＲ－３９、ｅｅｌ—ｒｕｉＲ一２３８标准品，，ＲＴ— ｑＰＣＲ检测ｅｅｌ－ｍｉＲ－３９、ｅｅｌ—ｍｉＲ－２３８及ｍｉＲ－３４２—３ｐ的水平，求 ＡＣｔ的平均值、标准差、ＣＶ。 １．８统计学处理数据使用ＳＰＳＳ１６．０统计软件进行统计分 析。样本ｃｔ值用 ±ｓ表示，样本ｃｔ值的批内、批间检测的变 异程度由ＣＶ公式［ＣＶ＝（ｓ ）１００ ］进行评价。 ２结 果 ２．１ ＲＮＡ提取液纯度及浓度鉴定 利用核酸／蛋白定量仪 Ｂｉｏｍａｔｅ ３测定试剂盒法提取的１ｏ份健康人血浆ＲＮＡ提取液 纯度及浓度，从表１可知，试剂盒抽提血浆ＲＮＡ的纯度可达 １．３Ｏ～１．９９，浓度可达５２．。０～７９．６０ ｎｇ／／，Ｉ ，表明试剂盒法可 以获得较高纯度和浓度的ＲＮＡ溶液，尽管核酸的ＯＤ２６０／２８０ 在１．８～２．０为理想比值，但是血浆ＲＮＡ丰度低和种类少的 特点决定了血浆ＲＮＡ抽提液的纯度和浓度不可能达到细胞 ＲＮＡ抽提液的标准。后续试验也进一步证实了表１中的 ＲＮ『Ａ足可以满足ｍｉＲＮＡｓ荧光定量ＲＣＲ的要求。 ７０．００ ６９．２Ｏ ５２．００ ５９．６０ ６０．８Ｏ ６４．００ ６８．４０ ６２．００ ２．２血浆ｍｉＲＮＡｓ ＲＴ—ｑＰＣＲ检测法溶解曲线分析 溶解曲 线显示所有标本中ｃｅｌ—ｍｉＲ－３９、ｃｅｌ—ｍｉＲ一２３８和ｍｉＲ－３４２—３ｐ的 产物溶解峰，扩增产物分别在８１．４４、８１．６２、８２．７１℃出现单一 峰，提示ＲＴ—ｑＰＣＲ法可以检测血浆中ｍｉＲＮＡｓ的表达且具有 较高的特异度，见图１。 溶解撼艘（ ）ａ ｉ軎孵ｉ 《（－ｃ）ｂ 湃解翟瘦（－ｃ）ｃ ａ图：Ｔｍ＝８１．４４℃，ｂ图：Ｗｍ ８１．６２℃，ｃ图：Ｔｍ一８２．７１℃ 图１ 血浆ｍｉＲＮＡｓ ＲＴ—ｑＰＣＲ检测法溶解曲线分析 ２．３血浆ｍｉＲＮＡ荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ批内、批间重复性验证 取两份不同浓度ＲＮＡ标本检测ｍｉＲ一３４２—３ｐ的表达水平，进 行批内及批间重复性验证，求ｃｔ值的平均值、标准差、ＣＶ。从 表２可知，对于ｍｉＲ一３４２—３ｐ浓度不同的核酸，ｃｔ值的标准差为 ０．１３～０．２０，ＣＶ为０．４２ ～０．６６ ，ＣＶ＜１ ，说明此方法具 有较好的批内及批问重复性。 ２．４ ｅｅｌ—ｍｉＲ－３９、ｅｅｌ—ｍｉＲ－２３８作为血浆ｍｉＲＮＡ外参的稳定性 验证将同一血浆标本分为５等份，依次加入等量的人工合成 的外参照ｃｅｌ—ｍｉＲ－３９、ｅｅｌ—ｍｉＲ－２３８标准品，再分别提取血浆 ＲＮＡ，ＲＴ—ｑＰＣＲ检测５组血浆中ｅｅｌ—ｍｉＲ一３９、ｃｅｌ－ｍｉＲ－２３８及 ｍｉＲ一３４２—３ｐ的水平，按公式ＡＣｔ—Ｃｔ ㈣４２ 一（Ｃｔ ｌ…Ｒ＿３９＋ Ｃｔ 。 ）／２计算出ＡＣｔ值，求ＡＣｔ值的平均值、标准差、ＣＶ， 结果见表２（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。 ２．５ ＣＶ作为血浆ｍｉＲＮＡｓ外参照的稳定性验证试验从表 ３可知（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”），对于同 一标本不同ＲＮＡ提取、逆转录及ＰＣＲ过程，外参照ｅｅｌ—ｍｉＲ－ ３９和ｃｅｌ－ｍｉＲ一２３８的Ｃｔ值分别保持在２１．４１～２２．６８及 １１．９５～１２．９６。５组血浆中外参ｃｅｌ—ｍｉＲ一３９和ｅｅｌ—ｍｉ ２３８ ｃｔ 值的标准差分别为ｏ．２７和ｏ．２１，ｃｖ分别为１．２３ 和１．６８ ， ＣＶ％２ ，ｍｉＲ－３４２—３ｐ ＡＣｔ的均值保持在１２．７１～１３．９５，标准差 为０．２２，ＣＶ为１．６８ ，ＣＶ％２ ，以上结果说明ｅｅｌ：ｍｉＲ－３９、ｅｅｌ－ ｍｉＲ－２３８可作为血浆ｍｉＲＮＡ ＲＴ－ｑＰＣＲ检测的稳定外参照。 ３讨 论 ｍｉＲＮＡｓ可通过胞外体、微囊泡、微粒等形式由细胞主动 国际检验医学杂志２０１５年１月第３６卷第１期Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１５，Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．１ ・ ５９ ・ 分泌至血液、唾液、尿液、乳汁、精浆、胸腹水等体液中ｌ＿４。］。血 浆中的ｍｉＲＮＡｓ既可作为疾病诊断的生物标志物，又可以胞 综上所述，本研究建立了用于循环ｍｉＲＮＡｓ检测的基于 茎环引物的实时荧光定量ＰＣＲ定量方法，该方法具有特异性 高、重复性好和稳定性强等优势，为循环ｍｉＲＮＡ研究提供了 较好的技术平台。 参考文献 ［１］ Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ 外体或微囊泡的形式被受体细胞所摄取，从而调控受体细胞的 功能 ］。但是，血浆中目标ｍｉＲＮＡｓ分子的低丰度，以及缺 乏稳定的定量ｍｉＲＮＡｓ的内参照使其难以建立适宜的检测 手段。 常用的ｍｉＲＮＡｓ检测方法包括ｍｉＲＮＡ原位杂交、ｍｉＲＮＡ 芯片、下一代测序、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ及实时荧光定量ＰＣＲ。ｍｉＲ— ＮＡ原位杂交是一种半定量的方法，优点是可以在细胞或组织 的原位检测ｍｉＲＮＡｓ中表达，但是对于低丰度的ｍｉＲＮＡ分子 容易产生信号噪音比。ｍｉＲＮＡ芯片和下一代测序的主要优点 是高通量，可以一次在同一样本中检测几百种ｍｉＲＮＡｓ的表 ｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００４，１１６（２）：２８１—２９７． Ｅ２］Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｂａ Ｙ，Ｍａ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｎｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｓｅｔ— ｕｍ：ａ ｎｏｖｅｌ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２００８，１８（１０）：９９７—１００６． Ｉ－３］Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＰＳ，Ｐａｒｋｉｎ ＲＫ，Ｋｒｏｈ ＥＭ，ｅｔ ａ１．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｉｉｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｓ ｓｔａｂｌｅ ｂｌｏｏｄ—ｂａｓｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｅｉ ＵＳＡ，２００８，１０５（３０）：１Ｏ５１３一ｌ０５１８． 达，所需样本量少，常用于初筛试验，但是缺点是容易产生假阳 性，需要用其他方法进行验证。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ常用来评价其他 检测方法的可靠性，但是通量低，且灵敏度和特异性都不高。 实时荧光定量ＰＣＲ是用于ｍｉＲＮＡｓ定量的最常用技术，目前 Ｅ４］Ｐａｒｋ ＮＪ，Ｚｈｏｕ Ｈ，Ｅｌａｓｈｏｆｆ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｓａｌｉｖａｒｙ ｍｉｃｒｏＲＮＡ：ｄｉｓｃｏｖｅｒ— ｙ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉ０ｎ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００９，ｌ５（１７）：５４７３—５４７７． 用于ｍｉＲＮＡｓ荧光定量ＰＣＲ的逆转录方法有两种，一种是 ｐｌｏｙ Ａ加尾法，另一种是茎环引物法。ＲＮＡ的抽提效果以及 Ｅ５３ Ｈａｎｋｅ Ｍ，Ｈｏｅｆｉｇ Ｋ，Ｍｅｒｚ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ａ ｒｏｂｕｓｔ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｕｒｉｎｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ａｓ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ一１２６ ａｎｄ ｍｉ— 内参照的稳定性直接影响最终定量结果。血浆中目标ｍｉＲ— ＮＡｓ丰度低的特点决定了常规Ｔｒｉｚｏｌ核酸抽提法难以获得高 浓度的核酸，本研究使用专门用于血浆ｍｉＲＮＡｓ抽提的试剂 盒，获得了较高浓度和纯度的核酸溶液。Ｕ６ ｓｎＲＮＡ作为细胞 ｍｉＲＮＡｓ相对定量的内参照，据研究报道血浆中并不恒定表达 Ｕ６ ｓｎＲＮＡｎ ，所以Ｕ６ ｓｎＲＮＡ不适宜作为循环ｍｉＲＮＡｓ定 ｅｒｏＲＮＡ－１８２ ａｒｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ３．Ｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌ：Ｓｅｍ Ｏｒｉｇ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１０，２８（６）：６５５—６６１． ｒ６］Ｋｏｓａｋａ Ｎ，Ｉｚｕｍｉ Ｈ，Ｓｅｋｉｎｅ Ｋ，ｅｔ ａ１．ｍｉｃｒｏＲＮＡ ａｓ ａ ｎｅｗ ｉｍｍｕｎｅ— ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｍｉｌｋ［Ｊ］．Ｓｉｌｅｎｃｅ，２０１０，１（１）：７－９． ［７］张娃洋，谢佳昀，梁宏伟，等．人体体液中细胞外ｍｉｃｒｏＲＮＡ的起 源、功能及潜在诊疗价值［Ｊ］．生物化学与生物物理进展，２０１３，４０ （７）：６０３－６１６． 量的内参照。本研究利用商品化ｍｉＲＮＡｓ试剂盒抽提健康人 血浆核酸分子，以ｃｅｌ—ｍｉＲ－３９、ｃｅｌ—ｍｉＲ一２３８为外参照，建立了基 于茎环引物的实时荧光定量ＰＣＲ检测技术，是一种可靠、稳定 的循环ｍｉＲＮＡｓ定量方法。 本文研究结果表明，基于茎环引物的实时荧光定量ＰＣＲ ［８］梁宏伟，陈熹，曾科，等．一种细胞间通信的新的信号分子…Ｍｉ ｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ运输的ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｒ－Ｊ］．分子诊断与治疗杂志。２０１０，２ （６）：４１７－４２３． ［９］Ｇｉｄｌ６ｆ ０，ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇ Ｍ，Ｏｈｍａｎ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｄｕｒ— ｉｎｇ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉＲＮＡ，ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｂｅ 具有特异性高、重复性好和稳定性强等优势。在对健康人血标 本循环ｍｉＲ一３４２—３ｐ的检测中，该方法的批内和批间ＣＶ分别 为０．６６ 和０．６３ ，均小于５ ，重复性较好。此外，通过多 次检测同一标本中ｍｉＲ一３４２—３ｐ、ｅｅｌ—ｍｉＲ一３９及ｅｅｌ—ｍｉＲ一２３８的 ｔａｋｅｎ ｕｐ ｂｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅ ＩＣＡＭ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］． Ｂｌｏｏｄ，２０１３，１２１（１９）：３９０８ ３９１７． ［１０］Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｌｉａｎｇ Ｈｗ，Ｇｕａｎ ＤＰ，ｅｔ ａ１．Ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｅｔ一７ｄ，Ｌｅｔ一 ７ｇ ａｎｄ Ｌｅｔ—‘７ｉ ｓｅｒｖｅｓ ａｓ ａ ｓｔａｂｌｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒ—－ 表达发现，ｍｉＲ一３４２—３ｐ ＡＣｔ的均值保持在１２．７１～１３．９５之间， 标准差为０．２２，ＣＶ为１．６８ ，小于５ Ａ，ｏ说明ｃｅｌ—ｍｉＲ－３９、ｃｅｌ— ｍｉＲ一２３８可作为血浆ｍｉＲＮＡ ＲＴ—ｑＰＣＲ检测的稳定外参照。 （上接第５６页） ｕｍ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１３，８（１１）：７９６５２． （收稿日期：２０１４—１１－０８） ｕｎｓｔａｂｌｅ ａｎｇｉｎａ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，１９９７，３４９（３）：４６２—４６６． ｒ１３］Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｍ，Ａｎｔｍａｎ ＭＤ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ ＧＳ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｂｙ ｒａｐｉｄ ｂｅｄｓｉｄｅ ａｓｓａｙ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，１９９９，３５４（９１）：４０７—４１３． ［９］徐继宾．血清同型半胱氨酸水平检测在冠心病诊断中的 应用价值［Ｊ］．中国现代药物应用，２０１４，８（１９）：５１—５２． ［１０］Ｂｏｕｓｈｅｙ ＣＪ，Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ Ｓ，Ｏｍｅｎｎ ＧＳ，ｅｔ ａ１．Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｈｏｍｏｅｙｓｔｅｉｎｅ ａｓ ａｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ｐｒｏｂａｂｌｅ ｂｅｎｅｆｉｔｓ ｏｆ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｒ ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ ＴＥＪ］．Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ，１９９７，１３３（３２）： ５９６． Ｅ１４］盛博，李志民．冠心病超敏ｃ反应蛋白、肌钙蛋白Ｔ与心 肌梗死面积的相关性研究［Ｊ］．海南医学院学报，２０１０，１６ （１０）：１２９８—１３００． ｉｎｔａｋｅｓ［Ｊ］．ＪＡＡＭ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ，１９９５，２７４（２７）：１０４９— １Ｏ５７． ［１５］Ｒｅｆｓｕｍ Ｈ，Ｓｍｉｔｈ ＡＤ，Ｕｅｌａｎｄ ＰＭ，ｅｔ ａｌ，Ｆａｃｔｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｍ— ｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ａｂｏｕｔ ｔｏｔａｌ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ：ａｎ ［１１］Ｓｔａｍｐｆｅｒ ＭＪ，Ｍａｌｉｎｏｗ ＭＲ．Ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｌａｓ— ｍａｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎ ＵＳ ｅｘｐｅｒｔ ｏｐｉｎｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，２００４，５０（１）：３－３２． （收稿日期：２０１４一１０—１８） ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ［Ｊ］．ＪＡＭＡ，１９９２，２６８（７）：８７７—８８１． ［１２］Ｆｒｉｔｓ Ｈ，Ｓｉｍｏｎ ＧＰ，Ｓｔｅｐｈｅｎ ＤＭ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ— ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ