豆豉纤溶酶生产菌液体发酵条件的优化

JournalofHenanUniversityofTechnology(NaturalScienceEdition)Vol.26,No.6

Dec.2005

文章编号:16732383(2005)06004304豆豉纤溶酶生产菌液体发酵条件的优化

孙月娥,钱󰀁和*

(江南大学食品学院,江苏无锡214036)

摘要:以DCFM9突变株为出发菌株,对其液体发酵条件进行了优化,得到了最佳发酵条件.优化后发酵培养基组成:木糖为20g,大豆蛋白胨为20g,KH2PO4为1g,K2HPO4󰀂3H2O为4g,Ca󰀁Cl2为0󰀂4g,MgSO4󰀂7H2O为0󰀂5g,水为1000mL;摇瓶发酵的最佳工艺条件为pH7󰀂4,接种量2%,种龄24h,装液量50mL/250mL,37 ,180r/min,发酵12h加入1g/L的Tween40.在此条件下发酵72h,产酶量最高可达3011󰀂08U/mL.关键词:豆豉;纤溶酶;液体发酵

中图分类号:TS201󰀂3󰀁󰀁󰀁󰀁文献标识码:B󰀁󰀁血栓疾病已超过癌症和糖尿病成为第一大健康杀手,溶解血栓是治疗这一类疾病的重要手段.目前全世界有血栓病人约1500万,所需溶栓剂的潜在市场有20亿美元[2].纤溶酶可催化血栓的主要基质纤维蛋白水解.链激酶(SK)、尿激酶(UK)等作为第一代溶栓药物对纤维蛋白无特异性选择作用,且有出血倾向;作为第二代纤溶药物的tPA等虽对纤维蛋白有很高的选择性,但依旧会导致出血等副作用,并且存在体内半衰期短、生产成本高、需大剂量连续用药等缺点[4].目前,纳豆激酶(NK)作为高效安全并可直接溶解纤维蛋白的纤溶酶[5,6],正在成为国内外溶栓药研究的焦点,而其来源食品纳豆就是我国细菌型豆鼓的孪生姐妹[7].由于二者菌株来源不同,因此本文将对豆豉纤溶酶产生菌产酶的各种因素进行研究,确定最优化发酵条件,以期最大限度地提高豆豉纤溶酶产生菌的产酶量.

[3]

[1]

KH2PO41,K2HPO4󰀂3H2O6,MgSO4󰀂7H2O0󰀂5,CaCl20󰀂2,血粉5,pH7󰀂2~7󰀂4,115 灭菌20min.

发酵基础培养基(g/L):蔗糖20,豆浆1000,KH2PO41,K2HPO4󰀂3H2O6,MgSO4󰀂7H2O0󰀂5,CaCl20󰀂4,pH7󰀂2~7󰀂4,115 灭菌20min.1󰀂3󰀁主要试剂

󰀁󰀁牛纤维蛋白原、纤维蛋白溶酶原、凝血酶、尿激酶:均购自中国药品生物制品检定所.1󰀂4󰀁培养方法

󰀁󰀁种子培养:挑取一环活化菌种接入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中,37 恒温振荡培养24h.

发酵培养:将种子接入发酵培养基中,振荡培养,按设计进行实验.

1󰀂5󰀁豆豉纤溶酶活性测定方法

参照尿激酶活性测定方法,以尿激酶(标准品)作纤溶活性标准曲线.

[8~10]

1󰀁材料与方法

2󰀁结果与分析

1󰀂1󰀁菌种

󰀁󰀁本实验室自行选育.1󰀂2󰀁培养基

种子培养基(g/L):蔗糖20,豆浆1000,

2󰀂1󰀁发酵培养基组成对豆豉纤溶酶产量的影响2󰀂1󰀂1󰀁氮源对产酶的影响

采用20g/L蔗糖为碳源,在液体发酵培养基中分别加入20g/L豆粕、豆渣、豆浆、豆粉、大豆

收稿日期:20050508作者简介:孙月娥(1973),女,吉林图们人,硕士研究生,研究方向为食品营养与安全.*责任作者蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、谷氨酸、柠檬酸、尿素、(NH4)2SO4、NH4NO3作为不同氮源,其他条件不变,研究氮源对发酵的影响.

󰀁󰀁由图1可见,有机氮比无机氮效果好,有机氮󰀁44河南工业大学学报(自然科学版)第26卷

中又以大豆蛋白胨为佳,这是因为该菌种是从豆豉中分离出来的,原始菌的生态环境为大豆中的有机氮.蛋白胨是蛋白质经酶、酸、碱水解后而获得的一种由月示、胨、肽、氨基酸组成的水溶性混合物,可被细菌直接分解利用,而豆渣、豆浆虽然都属于有机氮源,但它们需要在微生物分泌的蛋白酶作用下先被分解,然后才能被菌体吸收.

当氮源过多会使菌体生长过于旺盛,不利于代谢

产物的积累;氮源不足,菌体生长缓慢,不能满足酶合成的需要;碳源过多容易形成较低的pH值;碳源不足,容易引起菌体的衰老和自溶.此外,碳氮比不当,还会影响菌体对营养物质的吸收,直接影响菌体的生长和产物的合成.

2󰀂1󰀂4󰀁离子组成对产酶的影响

在发酵培养基中加入不同浓度的NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4,分析不同磷酸盐缓冲液对酶活的影响,见表2.然后再以KH2PO4、K2HPO4、CaCl2、MgSO4󰀂7H2O为因素各3个水平按L9(34)安排9组实验,分析金属离子对产酶的影响.

表2󰀁不同磷酸盐缓冲液对酶活的影响

图1󰀁不同氮源对发酵的影响

2󰀂1󰀂2󰀁碳源对产酶的影响

以20g/L大豆蛋白胨为氮源,分别取葡萄糖、果糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、米糠、麸皮作为碳源,浓度20g/L,进行发酵试验.从图2可看出,产酶效果以木糖最佳,乳糖次之,然后是可溶性淀粉,这可能是由于木糖作为五碳糖,是纤维素的组成糖,更易被栖息于木材上的微生物吸收利用.

磷酸盐比例K2HPO4!KH2PO4K2HPO4:NaH2PO4Na2HPO4:KH2PO4Na2HPO4:NaH2PO4

12485󰀂152125󰀂762019󰀂531957󰀂68

22558󰀂32444󰀂211917󰀂181818󰀂52

42813󰀂32691󰀂481877󰀂291780󰀂1

62590󰀂542396󰀂772326󰀂811742󰀂26

󰀁注:磷酸二氢盐浓度为0󰀂1g/L.

󰀁󰀁由表2可见,使用K2HPO4!KH2PO4=4!1时效果最好,用其作正交试验,由表3可知,当发酵液离子组成为A2B2C3D1,即K2HPO44g/L、KH2PO41g/L、CaCl20󰀂4g/L、MgSO40󰀂5g/L时产酶量最高.

表3󰀁不同金属离子对产酶的影响

试验号123456789k1k2k3R

K2HPO4A

1(2)112(4)223(8)335729󰀂348085󰀂95058󰀂01671󰀂33

KH2PO4B1(0󰀂5)2(1)3(2)1231236436󰀂937502󰀂017600󰀂261163󰀂33

CaCl2C

1(0)2(0󰀂2)3(0󰀂4)2313126785󰀂137195󰀂657558󰀂42773󰀂29

MgSO4D

1(0)2(0󰀂5)3(1)3122317017󰀂187296󰀂857225󰀂17207󰀂99

酶活/(U󰀂mL-1)

1476󰀂462061󰀂552191󰀂332468󰀂152874󰀂772742󰀂982492󰀂322565󰀂692665󰀂95

图2󰀁不同碳源对发酵的影响

2󰀂1󰀂3󰀁碳氮比对产酶的影响

按表1设计的方案比较不同碳氮比对产酶的影响.

表1󰀁碳氮比对发酵的影响

碳源/(g󰀂L-1)

30302020101020

氮源/(g󰀂L-1)

20103010302020

酶活/(U󰀂mL-1)

1226󰀂131197󰀂122396󰀂772303󰀂861255󰀂631579󰀂052590󰀂54

2󰀂1󰀂5󰀁表面活性剂对产酶的影响

表面活性剂可以直接或间接控制磷脂的生物合成从而影响细胞膜组成,增加细胞膜通透性以促进胞外酶等分泌物的分泌󰀂由表4可看出,表面活性剂添加的时间和添加量十分重要.本实验中以1g/L的Tween40在发酵12h加入效果最好.

󰀁󰀁由表1可见,当碳源为20g/L、氮源为20g/L,即C/N为1!1时,产酶量最高.这是因为第6期孙月娥等:豆豉纤溶酶生产菌液体发酵条件的优化

表4󰀁表面活性剂对发酵的影响

󰀁45U/mL

表面活性剂0h加入12h加入24h加入

Tween40/(g󰀂L-1)0󰀂5122492󰀂322717󰀂112019󰀂532040󰀂492928󰀂742213󰀂542717󰀂112349󰀂992640󰀂66

0󰀂5

61󰀂33305󰀂172691󰀂48

SDS/(g󰀂L-1)

10󰀂00278󰀂80637󰀂12

20󰀂0053󰀂06167󰀂080󰀂52169󰀂341476󰀂461998󰀂78

聚乙二醇/(g󰀂L-1)

122191󰀂332213󰀂542516󰀂582742󰀂982104󰀂182349󰀂99

2󰀂1󰀂6󰀁生长因子对产酶的影响

在培养基其他成分保持不变时,按正交设计表改变生长因子的种类,分别加入玉米浆(含大量

的硫胺素)、L-谷氨酸及生物素,在最佳培养条件下培养,选择最佳生长因子.

󰀁󰀁按L9(3)安排9组实验,结果列于表5.

表5󰀁生长因子对产酶的影响

试验号123456789

玉米浆生物素L󰀁谷氨酸A1(0)112(5)223(10)33

B1(0)2(0󰀂2)3(0󰀂4)123123

C1(0)2(0󰀂5)3(1󰀂0)231312

纤维蛋白粉D1(0)2(5)3(10)312231

酶活/(U󰀂mL-1)2928󰀂742541󰀂092082󰀂821270󰀂542326󰀂811650󰀂19933󰀂27723󰀂632590󰀂54

4

发酵72h后的纤溶酶活,由图5可见,发酵培养基的pH值对豆豉纤溶酶的合成有很重要的影响当培养基的起始pH值偏酸或偏碱都不利于产酶,而当pH值7󰀂4时产酶活性最高.

图4󰀁培养时间对产酶的影响

图5󰀁起始pH对产酶的影响

󰀁󰀁由表5可见,无外援生长因子时酶活最高,这是因为在自然界中自养型细菌和大多数腐生细菌都能自己合成许多生长辅助物质,不需要另外供给就能正常生长发育.

2󰀂2󰀁发酵工艺条件对豆豉纤溶酶产量的影响2󰀂2󰀂1󰀁培养温度对产酶的影响

将发酵温度分别设定在25 、30 、37 、40 ,考察发酵温度对豆豉纤溶酶产量的影响.由图3可见,发酵温度为37 时,酶的产量最高.

2󰀂2󰀂3󰀁转速和装液量对产酶的影响

当其他条件不变时,在250mL三角瓶中装入不等量的发酵培养基进行产酶试验,随后在250mL三角瓶中装入50mL发酵培养基,研究不同转速对产酶的影响.结果见图6和图7.

图6󰀁转速对产酶的影响

图3󰀁培养温度对产酶的影响

2󰀂2󰀂2󰀁培养时间对产酶的影响

发酵过程中,在24h、36h、48h、60h、72h、84h各取出一瓶,离心取上清液,用纤维蛋白琼脂糖法测定酶活,以确定最佳培养时间,由图4可见,发酵72h时产酶量最高.

2󰀂2󰀂2󰀁起始pH的确定

以大豆蛋白胨为氮源,木糖为碳源,浓度均为20g/L,用HCl和NaOH调整培养基起始pH分别为6󰀂0、6󰀂5、7󰀂0、7󰀂2、7󰀂4、7󰀂6、7󰀂8、8󰀂0,检测其在图7󰀁装液量对产酶的影响

󰀁󰀁由图6、图7可见,转速和装液量对纤溶酶产量有较大的影响,当转速为180r/min,培养基装

液量为10mL时发酵液的酶活最高.这是因为当转速一定时减少三角瓶中的装液量,或者装液量󰀁46河南工业大学学报(自然科学版)

参考文献:

第26卷

一定时增加转速,可以使溶氧系数提高,利于产酶.但装液量少会使细菌更早进入衰亡期,不利于产酶总量的增加.

2󰀂2󰀂4󰀁接种量的确定

将新鲜培养的种子液按1%、1󰀂5%、2%、2󰀂5%、3%、3󰀂5%、4%、5%的接种量接入发酵培养基中,37 、180r/min培养72h后测定酶活.图8表明2%接种量最佳,高接种量反而不利于产酶.

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(下转第49页)图8󰀁接种量对产酶的影响

2󰀂2󰀂5󰀁种龄的确定

将菌种接入种子培养基分别培养12h、16h、20h、24h、36h、48h后以2%的接种量接入发酵培养基,培养72h,后测酶活,由图9可以看出,当种龄为24h时产酶最佳,幼龄种子和老化种子产酶较低.

图9󰀁种龄对产酶的影响

3󰀁小结

豆豉在我国民间一直作为药食兼用的食品,而源于豆豉的纳豆在日本也一直被视作预防心脑血管疾病的良药[12].从须见洋行等发现了纳豆激酶以来,纳豆激酶以其强烈溶栓作用、可以降低血液粘度、降血脂、降胆固醇、改善血液循环状况,维持血细胞的正常形态和功能等多种生理功能引起欧美学者的广泛兴趣[12,13].本文旨在对从豆豉中得到的纤溶酶高产菌DCFM9的发酵条件进行优化,优化后发酵培养基组成为木糖20g,大豆蛋白胨20g,KH2PO41g,K2HPO4󰀂3H2O4g,CaCl20󰀂4g,MgSO4󰀂7H2O0󰀂5g,水1000mL.摇瓶发酵的最佳工艺:pH7󰀂4,接种量为2%,种龄24h,装液量50mL/250mL,37 ,180r/min,发酵12h加入1g/L的Tween40,在此条件下发酵72h,产酶量最高可达3011󰀂08U/mL.[11]

第6期霍权恭等:储藏条件对马铃薯品质的影响󰀁49

能以表皮绿化程度判断.

3󰀁结论

测定数据与观察结果表明,马铃薯表皮中叶绿素是由光照刺激产生的,表皮绿化速度完全取决于光照时间和强度,而且叶绿素在表皮细胞中不扩散;马铃薯配糖生物碱是其正常生理代谢的产物,它的生成不受光照的控制,与有关文献报道的结论是一致的[3].在低温条件下,马铃薯的生理代谢受到抑制,表皮中叶绿素和配糖生物碱的合成受到抑制;10 以上的温度和光照,使马铃薯表皮中叶绿素合成和芽萌发速度加快,其表皮绿化速度和配糖生物碱含量迅速增加.但是,马铃薯中配糖生物碱含量水平应以发芽程度判断,而不

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EFFECTSOFSTORAGECONDITIONONTHEPOTATOQUALITY

HUOQuan󰀁gong,FANLu

(1󰀂SchoolofFoodScienceandTechnology,HenanUniversityofTechnology,Zhengzhou450052,China;2󰀂SchoolofChemistryandChemicalEngineering,HenanUniversityofTechnology,Zhengzhou450052,China)Abstract:Theeffectsoflighting,storagetimeandstoragetemperatureonthegreeningspeedandtotalglycoalka󰀁loids(TAG)contentofpotatowereinvestigated󰀂Theresultshowedthattherewasnogreeninginthecortexofpota󰀁toeswhentheywerestoredunderdarknessfor20days,however,thecontentofTAGinthecortexandthearoundtheeyesincreasedfrom1󰀂5%to73󰀂5%and2󰀂4%to86󰀂2%respectively󰀂Whentheywerestoredunderlightingfor20days,thegreeningspeedofpotatoesandthecontentofTGAincreasedrapidlywithincreasingthestoragetemperature,thecontentofTAGinthecortexandaroundtheeyeincreasedfrom2󰀂5%to189󰀂1%and1󰀂9%to233󰀂8%respectivelyaswellasthecontentofTGAinsproutscouldreachto137󰀂3mg/100g󰀂Thetotalglycoalka󰀁loidsofpotatowaspositive󰀁correlatedwithgerminativedegree,notwiththegreeningonthecortex󰀂KeyWords:potato;totalglycoalkaloids(TAG);storage(上接第46页)

1

2

THEOPTIMIZATIONOFLIQUIDFERMENTATIONCONDITIONOF

DOUCHIFIBRINOLYTICENZYMEPRODUCINGSTRAIN

SUNYue󰀁e,QIANHe

(SchoolofFoodScienceandTechnology,SouthernYangtzeUniversity,Wuxi214036,China)

Abstract:UsingmutantstrainDCFM9asstartingstrain,theoptimalliquidfermentationconditionofenzymeproduc󰀁tionwasstudied󰀂Theoptimalcomponentoftheculturemediumwasthat:xylose20g,peptone20g,KH2PO41g,K2HPO4󰀂3H2O4g,CaCl20󰀂2g,MgSO4󰀂7H2O0󰀂5g󰀂Theoptimalliquidfermentationconditionwas:pH7󰀂4,theinocu󰀁latingquantitywas2%(V/V),cellage24h,liquidamount50mL/250mL,temperature37 ,180r/min,add1g/LTween󰀁40afterculturedfor12h󰀂Underthiscondition,theenzymeproducedbyDCFM9couldreach3011󰀂08U/mL󰀂Keywords:Douchi;fibrinolyticenzyme;liquidfermentation