云南传统发酵豆豉中高产豆豉纤溶酶菌株的筛选及其酶谱分析

#研究报告#BIOTECHNOLOGY BULLETIN

2011年第5期云南传统发酵豆豉中高产豆豉纤溶

酶菌株的筛选及其酶谱分析

宋园亮 黄文宇 张忠华 吴少雄 殷建忠 柳陈坚

1

1

1

2

2

(1昆明理工大学生命科学与技术学院应用微生物研究室,昆明650224;2昆明医学院,昆明650500)

1

摘 要: 从云南昆明、元阳、玉溪、昭通地区采集豆豉样品26个,通过琼脂-纤维蛋白平板试验,SDS-fibrin-PAGE蛋白电泳结合Zymography活性染色对相应酶谱进行分析;同时采用茚三酮法测定其豆豉纤溶酶活性,筛选得到5株豆豉纤溶酶活性较高的菌株,其中尤以ZT-13菌株纤溶酶活性达到97109U/mL,是工业化生产豆豉纤溶酶的潜在优良菌株。

关键词: 豆豉 豆豉纤溶酶 酶谱分析

ScreeningofHigh-yieldDouchiFibrinolyticEnzymeProducingStrains

fromYunnanTraditionalFermentedDouchiandZymographyAnalysis

SongYuanliang HuangWenyu ZhangZhonghua WuShaoxiong YinJianzhong LiuChenjian

1

1

1

2

2

1

1

(LaboratoryofAppliedMicrobiology,FacultyofLifeScienceandTechnology,KunmingUniversityofScienceandTechnology,

Kunming650224;KunmingMedicalUniversity,Kunming650500)

2

mpleswerecollectedfromKunming,Yuanyang,Yux,iZhaotongregionandYunnanprovince.Byagar-f-i Abstrac:t 26Douchisa

brinplatetest,SDS-fibrin-PAGEproteinelectrophoresiscombiningzymographystainingtoanalyzethepatternofsecretedenzymes.Meanwhile,thefibrinolyticactivitywasdeterminedbyNinhydrinmethod.Therewere5strainsscreenedwithhigh-yieldfibrinolyticac-tivity.Especially,theZT-13strainoffibrinolyticactivitywashighandreached97.09U/mL.Itisapotentialstrainforproducingindus-trialfibrinolyticenzyme.

Keywords: Douchi Douchifibrinolyticenzyme Zymography

豆豉是以大豆为发酵基质,经微生物发酵作用酿造而成的传统发酵食品,不但其风味独特、营养丰富、富含多种生理活性物质;而且具有开胃增食、消

[1,2]

积化滞、驱风散寒及预防心脑血管疾病等功效。豆豉纤溶酶是在豆豉发酵过程中由枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)产生的一种丝氨酸蛋白酶,具有明显的溶栓作用,可用于预防和治疗血栓疾病;该酶分子量小,可通过消化道直接吸收。因此,无论作为抗血栓药物,还是作为预防血栓疾病的功能性保健食品,都具有十分重要的研究与开发前景。

云南省特殊的地理环境和多样的人文优势,创

[3-5]

造了云南特有的传统发酵豆豉资源,形成以太和豆豉、水豆豉、风吹豆豉、哈尼豆豉、五香豆豉及豆豉条等为代表的传统发酵豆豉。这些独具特色的传统发酵豆豉中蕴藏着乳酸菌及枯草芽孢杆菌等微生物资源。本研究从云南昆明、元阳、玉溪及昭通主要传统豆豉产区采集豆豉样品,通过琼脂-纤维蛋白平板试验,同时采用SDS-fibrin-PAGE蛋白电泳结合Zy-mography活性染色,并采用茚三酮法测定其纤维蛋白酶活性,从云南传统发酵豆豉中筛选高产豆豉纤溶酶的微生物,为豆豉纤溶酶的工业化生产提供优良菌株。

收稿日期:2010-11-10

基金项目:云南省科技厅面上项目(KKSA200926038)

作者简介:宋园亮,男,硕士研究生,研究方向:应用食品微生物;E-mai:lstrong1985@126.com通讯作者:柳陈坚,博士,副教授,研究方向:应用微生物与人兽共患传染病;E-mai:lnewstaar8@hotmai.lcom

2011年第5期 宋园亮等:云南传统发酵豆豉中高产豆豉纤溶酶菌株的筛选及其酶谱分析

127

1 材料与方法

111 材料

11111 材料与试剂 从云南昆明、元阳、玉溪及昭通主要传统发酵豆豉产地采集的豆豉样品26个。

主要试剂:纤维蛋白(MP);琼脂糖(Sigma);硼酸(天津双船化学);茚三酮,氯化锡,三氯乙酸;纤维蛋白诱导培养基:017%磷酸氢二钾;012%磷酸二氢钾;0101%MgSO4#7H2O;0105%柠檬酸;011%酵母提取物;013%纤维蛋白;110%蛋白胨;110%葡萄糖。

11112 仪器与设备 电子分析天平(德国赛多利斯);二氧化碳恒温培养箱(NAPCO6500TC);全自动高压灭菌锅(TOMY);低温冰箱(青岛海尔);恒温水浴锅(日本ASONE);冷冻高速离心机(Sigma);恒温摇床;台式混匀仪;Genova紫外分光光度计;Bio-Red垂直电泳仪。

112 方法

11211 菌种的分离与保存 称取豆豉样品1g,放入5mL灭菌的生理盐水中,震荡混匀后取20LL接种到营养肉汤培养基中,35e,150r/min摇床培养

-5

48h。将菌液用生理盐水10倍梯度稀释,应用10和10倍的稀释液20LL直接涂于NA平板,在35e培养48h后,挑选形态不同的单菌落,接种至营养肉汤培养基中,35e,150r/min摇床培养48h后,应用50%甘油保存至-80e冰箱以备后续研究使用。

11212 明胶液化试验 将分离保存的菌种迅速融化,取20LL添加至17%明胶的营养肉汤培养基中,35e培养48h,随后置于4e冰箱中20min,观察试管中的明胶是否凝固。若明胶液化,即判定为阳性菌株。

11213 豆豉纤溶酶产生菌的筛选 将20LL所保存的明胶阳性菌株的菌液接种于5mL已灭菌的新鲜营养肉汤培养基中,置于35e恒温培养24h,随后振荡混匀,取20LL接种于5mL的纤维蛋白诱导培养基中,150r/min,37e预培养48h。紧接将20LL经诱导培养的菌液接种至20mL的三角烧瓶正培养基中,150r/min,37e摇床培养48h。然后取培养液1mL,5000RCF,离心30min,取培养上清保存以进行后续的纤维蛋白酶活性测定。-6

将10LL培养上清添加至琼脂)纤维蛋白平板

(013g纤维蛋白粉末和011g琼脂粉用100mL硼酸缓冲液混合均匀,37e水浴加热30min左右倒平板,凝固后在平板上均匀打5-6个孔),置于恒温箱中37e培养48h,然后分别测定不同时间(24h,48h)纤维蛋白溶蛋白圈的直径,其大小近似为豆豉纤溶酶的酶活

[6-9]

。

11214 SDS-Zymography酶谱法 本试验将SDS-Zy-[10-12]mography酶谱法进行改良,在制作凝胶时(浓缩胶浓度为3%,分离胶浓度为15%),用015%纤维蛋白溶液替换明胶作为豆豉纤溶酶的底物,通过凝胶电泳将分子量不同的豆豉纤溶酶分离后除去SDS,恢复豆豉纤溶酶活性。凝胶内恢复活性的豆豉纤溶酶在一定条件下将其所在位置的底物纤维蛋白水解,然后用考马斯亮蓝染色,再用脱色液脱色后,凝胶染成蓝色,而底物被水解处可见亮带,根据条带的数量及亮度可以初步判断样品中蛋白酶的种类和酶活的高低。取粗酶液20LL,5LLLoadingBuffer,上样量20LL,缓慢加入以防样品从泳道中溢出,电压100V,4e、2h。电泳结束后,将SDS-f-ibrin-PAGE进行Zymography活性染色,显像记录。11215 豆豉纤溶酶活性的测定 采用茚三酮法测定,将其作部分改良,底物换为016%的纤维蛋白溶液,在570nm处测定样品酶液的OD值,进而换算成豆豉纤溶酶活性。亮氨酸标准曲线方程如下:

y=01191x-01004(R=01999)

豆豉纤溶酶活性单位定义为:1mL酶液在37e,pH715的条件下,每分钟水解纤维蛋白所产生1Lmol亮氨酸的酶量为一个酶活性单位,以U/mL表示。

2

[13-15]

2 结果与分析

211 不同地区豆豉纤溶酶的筛选结

21111 昆明地区豆豉纤溶酶的筛选结果 从昆明豆豉中分离得到的14株明胶试验阳性菌株,只有KM-13、KM-14两株菌株出现溶蛋白圈,其余菌株均未出现溶蛋白圈(图1)。随着培养时间增加,溶蛋白圈的直径也随之增大,48h时的溶蛋白圈直径要明显大于24h的溶蛋白圈直径。菌株KM-13不同培养时间的溶蛋白圈直径分别为15mm和18mm;KM-14菌株不同培养时间的溶蛋白圈直径分别为14mm和16mm。128生物技术通报Biotechnology Bulletin

2011年第5期图3 元阳菌株的纤维蛋白)琼脂平板结果

A.培养24h的溶蛋白圈;B.培养48h的溶蛋白圈

图1 昆明菌株的纤维蛋白)琼脂平板结果

酶谱分析(图2)表明,将菌株KM-13、KM-14分别培养24h与48h,其凝胶上均有亮带产生,且培养48h的亮带亮度较强,表明这两株菌株均分泌相应的豆豉纤溶酶,其结果与纤维蛋白)琼脂平板的筛选结果相吻合。

1.H-3培养24h的粗酶液;2.H-3培养48h的粗酶液

图4 元阳菌株的不同培养时间的酶谱结果

21113 玉溪地区豆豉纤溶酶的筛选结果 从玉溪豆豉中分离得到的15株明胶试验阳性菌株,除YX-14和YX-23两株菌株没有出现溶蛋白圈外,其余菌株均出现了溶蛋白圈,其不同培养时间的溶蛋白圈直径,如表1。

1.KM-13培养24h的粗酶液;2.KM-13培养48h的粗酶液;3.KM-14培养24h的粗酶液;4.KM-14培养48h的粗酶液

表1 玉溪13株菌株不同培养时间的溶蛋白圈直径

菌株名称YX-1

YX-3YX-6YX-9YX-10YX-11YX-13YX-17YX-18YX-19YX-20YX-22YX-26

24h溶蛋白圈直径(mm)

15161413161314141213151113

48h溶蛋白圈直径(mm)

21201717171918171817171416

图2 昆明菌株的不同培养时间的酶谱结果

21112 元阳地区豆豉纤溶酶的筛选结果 从元阳豆豉中分离得到的7株明胶试验阳性菌株,只有H-3菌株出现溶蛋白圈,余菌株均未出现溶蛋白圈,并且培养48h的溶蛋白圈直径比24h的溶蛋白圈直径大4mm之多(分别为17mm和21mm);酶的活性随着培养时间的延长明显增强,48h培养的酶活比24h培养的高(图3),其Zymography的酶谱显示两条明亮的条带,说明H-3菌株可能分泌两种纤溶酶(图4)。

2011年第5期 宋园亮等:云南传统发酵豆豉中高产豆豉纤溶酶菌株的筛选及其酶谱分析

129

由表1,图5可见,13株菌株均分泌相应的豆豉纤溶酶,其中YY-1、YY-3和YY-11培养48h的溶蛋白圈直径最大,其Zymography活性染色的条带也较明亮,且培养48h的豆豉纤溶酶活性要强于培养24h的豆豉纤溶酶的活性,该结果与纤维蛋白)琼脂平板的筛选结果相吻合;YY-1、YY-3、YY-11和YY-13产生一条亮带,在蛋白酶谱上显示在同一位置,说明这两株菌株所分泌的纤溶酶分子量相同;YY-6、YY-9、YY-10的亮带强度较弱,其中YY-9产

生4条较弱的条带,推测其可能产生4种分子量不

同的纤溶酶;YX-17、YX-18、YX-19和YX-20培养24h在蛋白酶谱上产生一条亮带,且在同一位置,培养48h后,均出现一条较弱的条带,推测这4株菌株可能分泌分子量相同的纤溶酶;YX-22、YX-26培养24h后,其蛋白酶谱显示3个条带,其位置相近,且最上方的条带较亮,下方的条带亮度较弱,继续培养,48h后,YX-26下方又出现两个较弱的条带,而YX-22则未出现。

1-8.YX-1(24h),YX-1(48h),YX-3(24h),YX-3(48h),YX-6(24h),YX-6(48h),YX-9(24h),YX-9(48h);9-14.YX-10(24h),YX-10(48h),YX-11(24h),YX-11(48h),YX-13(24h),YX-13(48h);15-22.YX-17(24h),YX-17(48h),YX-18(24h),YX-18(48h),YX-19(24h),YX-19(48h),YX-20(24h),YX-20(48h);23-26.YX-22(24h),YX-22(48h),YX-26(24h),YX-26(48h)

图5 玉溪菌株的不同培养时间的酶谱结果

21114 昭通地区豆豉纤溶酶的筛选结果 从昭通豆豉中分离得到的10株明胶试验阳性菌株,除ZT-2、ZT-3和ZT-25三株菌株没有出现溶蛋白圈外,其余菌株均出现了溶蛋白圈(表2)。

由表2可见,ZT-13培养48h,其溶蛋白圈最大,达到26mm,并且7株菌培养48h的溶蛋白圈直径都大于24h的溶蛋白圈直径;其Zymography酶谱上所显示的纤溶酶的亮带的强弱显示,酶活随着培养时间的延长明显增强,48h的酶活性比24h酶活高(图6),这也印证了纤维蛋白)琼脂平板的筛选结果。ZT-1、ZT-5培养24h后,其蛋白酶谱显示

两条亮带,且在同一位置,培养48h后,均出现一条较弱的条带,推测这2株菌株可能分泌分子量相同

的纤溶酶;ZT-13、ZT-15培养24h后,其蛋白酶谱显示2条亮带,其位置相近,且最上方的条带较亮,下方的条带亮度较弱,继续培养,48h后,二者都未出现亮带;ZT-17、ZT-21培养24h后,蛋白酶谱显示3个条带,其位置相近,且最上方的条带较亮,下方的条带亮度较弱,继续培养,48h后,二者下方均出现一条较亮的条带,且ZT-21的亮度较强。ZT-29培养24h后,显示一条较亮的条带,继续培养,48h后无条带出现,由此可判断ZT-29只分泌一种纤溶蛋白酶。

130生物技术通报Biotechnology Bulletin

表2 昭通7株菌株不同培养时间的溶蛋白圈直径

2011年第5期株的豆豉纤溶酶活性仅分别为37115U/mL和26199U/mL,与其他三个地区相比,其活性相当低。

表3 不同地区豆豉纤溶酶活性

菌株编号H-3YX-1YX-3

酶活(U/mL)

521979612274116571917218570110931883711547160961663715936143

菌株编号YX-22YX-26ZT-1ZT-5ZT-13ZT-15ZT-17ZT-21ZT-29KM-13KM-14

酶活(U/mL)

3814656146441415613197109941615710456189431253711526199

菌株名称ZT-1ZT-5ZT-13ZT-15ZT-17ZT-21ZT-29

24h溶蛋白圈直径(mm)

16161910181812

48h溶蛋白圈直径(mm)

19202615222115

YX-6YX-9YX-10YX-11YX-13YX-17YX-18YX-19YX-20

3 讨论

本试验建立了一种新的筛选豆豉纤溶酶的方法,通过纤维蛋白平板法对样品进行初筛,随后采用改良的酶谱法对样品中豆豉纤溶酶的种类进行分析,并结合茚三酮法测定其酶活。酶谱分析印证了豆豉纤溶酶活性测定法的准确性,为高产豆豉纤溶

1-4.ZT-1(24h),ZT-1(48h),ZT-5(24h),ZT-5(48h);5-12.ZT-13(24h),ZT-13(48h),ZT-15(24h),ZT-15(48h),ZT-17(24h),ZT-17(48h),ZT-21(24h),ZT-21(48h);13,14.ZT-29(24h),ZT-29(48h)

酶菌株的筛选提供了更为简便而准确的方法保证。

本研究通过纤维蛋白平板法对云南省四个地区的豆豉样品中产蛋白酶菌株的纤溶酶活性进行了评价。昆明地区的14个菌株中,只有KM-13、KM-14两株菌出现溶蛋白圈,产纤溶酶菌株获得率为1413%。元阳地区的7株菌株中,只有H-3出现了溶蛋白圈,产纤溶酶菌株获得率为14.3%。玉溪地

区的15株菌株中,YX-1、YX-3、YX-6和YX-9等13株菌株均出现了溶蛋白圈,产纤溶酶活性较高,其获得率高达8617%。昭通地区的10个菌株中,ZT-1、ZT-5、ZT-13和ZT-15等7株菌株出现了溶蛋白圈,其获得率为70%。由此可见,玉溪豆豉样品产豆豉纤溶酶的微生物较多,其次是昭通地区。

SDS-fibrin-PAGE和茚三酮纤溶酶活性测定证实了上述结果,其中YX-1菌株的纤溶酶活性达96122U/mL,YX-11菌株的纤溶酶活性达到93188U/mL,YX-18菌株的纤溶酶活性达到96166U/mL,图6 昭通菌株的不同培养时间的酶谱结果

212 不同地区豆豉样品由来微生物所产豆豉纤溶

酶活性

由表3可见,YX-1、YX-11、YX-18、ZT-13和ZT-15五株菌株的豆豉纤溶酶活性最高,其中YX-1由来豆豉纤溶酶活性达到96122U/mL,YX-11的酶活达到93188U/mL,YX-18的酶活性达到96166U/mL,ZT-13的酶活达到97109U/mL,ZT-15的酶活达到94161U/mL。其次是YX-3和YX-9两株菌株,其酶活分别达到74116U/mL和72185U/mL,元阳H-3菌株的豆豉纤溶酶活性为52191U/mL,该菌株低于玉溪和昭通两个地区所分离得到菌株由来的豆豉纤溶酶活性。而昆明地区的KM-13、KM-14两菌2011年第5期 宋园亮等:云南传统发酵豆豉中高产豆豉纤溶酶菌株的筛选及其酶谱分析

131

ZT-15菌株纤溶酶活性达到94161U/mL,而ZT-13菌株的纤溶酶活性高达97109U/mL。由于酶活测定方法的不同,因此本研究中所分离得到的5株高产菌株的豆豉纤溶酶活性低于文献报道的水准。

参考文献

[1]马力.豆豉纤溶酶的研究进展.肉类研究,2007(9):15-18.[2]SirtoriCR,LovatiMR.Soyproteinsandcardiovasculardisease.Curr

AtherosclerRep,2001,3(1):47-53.

[3]李江伟,冉国侠.豆豉溶栓酶的分离纯化及其体外溶栓作用.中

国生物药物杂志,1999,20(3):148-150.

[4]王金英,刘宇峰,王占斌,等.豆豉抗栓作用的研究.生物技术,

1997,7(5):18-20.

[5]范晓丹,郭勇.豆豉纤溶酶)))一种潜在的新型溶栓药物.生命

的化学,2005,25(5):427-429.

[6]向梅,吴思方,王伟平,等.豆豉纤溶酶产生菌的筛选及菌种鉴

定.微生物学杂志,2005,25(1):21-24.

[7]董明盛,江晓,刘诚,等.胞外纤溶酶产生菌的筛选及其产酶条件

研究.食品发酵工业,2001,27(1):23-27.

[8]齐海萍,钱和,王璋,等.高活性豆豉纤溶酶产生菌出发菌株的筛

选.中国调味品,2004(2):12-15.

[9]鲁艳莉,宁喜斌.发酵豆制品中产溶纤酶菌株的筛选.中国调味

品,2005(8):13-16.

[10]LeberTM,BalkwillFR.Zymography:asingle-stepstainingmethod

forquantitationofproteolyticactivityonsubstrategels.AnalBio-chem,1997,249(1):24-28.

[11]刘志勇.多西环素抑制恶性黑色素瘤小鼠移植瘤模型的初步实

验研究[D].天津:天津医科大学,2006.

[12]张金玲.甘草次酸对白血病细胞侵袭和迁移能力的影响及机制

探讨[D].武汉:华中科技大学,2008.

[13]KangSI,JangYB,ChoiYJ,etal.Purificationandpropertiesofa

collagenolyticproteaseproducedbymarinebacteriumVibriovulnifi-cusCYK279H.BiotechnolBioprocessEng,2005,10(6):593-598.[14]刘丽莉,马美湖,余秀芳,等.胶原蛋白酶产生菌的筛选及酶的

分离纯化.生物工程学报,2010,26(2):194-200.

[15]杨光垚,谢君,徐宁,等.具胶原蛋白酶活性铜绿假单胞菌的筛

选.微生物学通报,2004,31(5):43-48.

(责任编辑 马鑫)