一种凝结芽孢杆菌及利用其制备L-乳酸的方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112694993 A(43)申请公布日 2021.04.23

(21)申请号 202011636200.8(22)申请日 2020.12.31

(83)生物保藏信息

CCTCC NO:M 2020371 2020.07.28(71)申请人 安徽丰原生物技术股份有限公司地址 233700 安徽省蚌埠市固镇县经济开

发区经二路东、纬四路北(72)发明人 李荣杰　穆晓玲　陈思弘　杨金环　王舒　孟瑶　(74)专利代理机构 北京睿阳联合知识产权代理

有限公司 11758

代理人 郭奥博　张颖(51)Int.Cl.

C12N 1/20(2006.01)C12P 7/56(2006.01)

(54)发明名称

一种凝结芽孢杆菌及利用其制备L-乳酸的方法

(57)摘要

本发明提供了一种凝结芽孢杆菌及利用其制备L‑乳酸的方法。所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FYLR2，其保藏编号为CCTCC M2020371，其16s rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。本发明提供的凝结芽孢杆菌可以以多种物质作为发酵碳源，通过分批发酵方法或连续发酵方法，具有单批次发酵时间短，总发酵时间长的优点，发酵能力强，可以得到碳源残余量极低甚至为零的发酵液，发酵液中L‑乳酸浓度高，且纯度极高。

C12R 1/07(2006.01)

权利要求书2页 说明书12页

序列表1页

CN 112694993 ACN 112694993 A

权　利　要　求　书

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1.一种凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌具有如SEQ ID No:1所示核苷酸序列的16s rRNA。

2.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FYLR2，于2020年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M2020371。

3.权利要求1或2所述的凝结芽孢杆菌在制备L‑乳酸中的应用。4.一种L‑乳酸的制备方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述的凝结芽孢杆菌发酵制备L‑乳酸。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法为分批发酵方法或连续发酵方法。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述分批发酵方法包括以下步骤：将种子培养液接入发酵培养基中进行发酵培养，得到含有L‑乳酸的发酵液，所述发酵培养的

优选为24～30h。时间≤36h，

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述分批发酵方法包括以下步骤：(1)活化权利要求1或2所述的凝结芽孢杆菌；(2)制备种子培养液；以及

(3)将种子培养液接入发酵培养基中进行发酵培养，得到含有L‑乳酸的发酵液，所述发酵培养的时间≤36h，优选为24～30h。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，当培养发酵至碳源残余量接近0停止发酵，优选低于0.02％，更优选为0％。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述连续发酵方法包括如下步骤：将种子培养液接入发酵培养基中进行连续发酵培养，得到多批次含有L‑乳酸的发酵液；

在连续发酵中，当前发酵装置中乳酸产量为110～160g/L时，优选120～150g/L时，和/或，葡萄糖浓度为30～90g/L，优选35～80g/L时，取出10～40vol％的发酵液接种到后续的发酵装置中进行后续的连续发酵。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述连续发酵方法包括以下步骤：(1)活化权利要求1或2所述的凝结芽孢杆菌；(2)制备种子培养液；以及

(3)将种子培养液接入发酵培养基中进行连续发酵培养，得到多批次含有L‑乳酸的发酵液；

在连续发酵中，当前发酵装置中乳酸产量为110～160g/L时，优选120～150g/L时，和/或，葡萄糖浓度为30～90g/L时，优选35～80g/L时，取出10～40vol％的发酵液接种到后续的发酵装置中进行后续的连续发酵。

11.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，所述连续发酵的总时间为30小时～180天，优选为30天～180天，更优选为30天～120天。

12.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，在所述连续发酵方法中，在取出10～40vol％的发酵液后，当前发酵装置中继续发酵至碳源残余量接近0，优选地，低于0.02％，更优选地为0％。

13.根据权利要求6‑7、9‑10中的任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养在

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40～60℃的温度下进行。

14.根据权利要求6‑7、9‑10中的任一项所述的制备方法，其特征在于，在发酵培养中，将培养基的pH值控制在5.5～7.5，进一步优选将培养基的pH值控制在6～7。

15.根据权利要求6‑7、9‑10中的任一项所述的制备方法，其特征在于，用于控制pH值的中和剂为碳酸钙或氢氧化钙，优选地，碳酸钙浓度为300～600g/L，氢氧化钙浓度为200～400g/L。

16.根据权利要求6‑7、9‑10中的任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基中的碳源选自核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、α‑甲基‑D‑葡萄糖甙、N‑乙酰‑葡糖胺、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖或淀粉中的任意一种或至少两种的组合。

17.根据权利要求6‑16中的任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：从所述含有L‑乳酸的发酵液中蒸馏提取得到L‑乳酸。

18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述蒸馏提取的方法包括：

提纯、浓缩和分子蒸馏提纯，得到所述L‑乳酸。对含有L‑乳酸的发酵液进行酸解、

19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，所述提纯的方法包括：经酸解得到的酸解液通过阳离子交换、阴离子交换以及活性炭脱色，得到提纯液。

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一种凝结芽孢杆菌及利用其制备L‑乳酸的方法

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技术领域

[0001]本发明属于生物发酵工程技术领域，涉及一种L‑乳酸的生产方 法，尤其涉及一种凝结芽孢杆菌及利用其制备L‑乳酸的方法。

背景技术

[0002]乳酸(Lactic Acid)，又名α‑羟基丙酸，根据旋光性不同可分为 L‑乳酸(左旋性)、D‑乳酸(右旋性)和消旋乳酸。乳酸是一种多用 途的有机酸，可广泛应用于食品、医药、化工、印染等领域。其中， 最重要、最广泛的工业应用是作为聚乳酸合成的单体。聚乳酸具有良 好的生物可降解性和生物相容性，不仅在当今石油资源日益短缺的情 况下很有希望成为石油基塑料的替代品，也被产业界认为一种最有发 展前途的新型医学材料。因此光学纯L‑乳酸的生产有着重要的意义。

[0003]乳酸的生产方法主要有微生物发酵法、化学合成法和酶催化法。 作为大规模生产中最主要的生产方法，微生物发酵法可以用纤维素、 淀粉等可再生资源的水解液作为原料生产乳酸，通过使用不同的菌株 可获得光学纯的L‑乳酸、D‑乳酸或是两者的混合物，其生产成本低， 产品安全性高，并且环境污染小。凝结芽孢杆菌是一种耐热的可发酵 生产光学纯L‑乳酸的微生物，可以实现在较高温度(45～60℃)条 件下的开放式发酵，很大程度上降低发酵过程中污染杂菌的可能性， 保证了终产物的高光学纯度。此外，凝结芽孢杆菌的营养要求低，可 以非常经济地进行大规模的发酵生产。

[0004]目前大规模的乳酸发酵采用分批发酵或连续发酵模式，分批发酵 模式技术要求低、操作简便、产物终浓度高，但在生产过程中发酵罐 的利用率偏低：分批发酵在每次发酵开始前的培养基配制、升温等准 备工作需要占用一定的时间；发酵结束后，发酵液的处理、排放、罐 体的清洗等也会占用较长时间，这都极大降低了发酵罐的利用率，增 加了生产成本。此外，为了配合分批发酵需要不断的进行种子液的制 备，制种过程的原料和能源消耗也会提高生产成本。

[0005]连续发酵方法可以极大的提高发酵罐的利用率，通过直接利用前 一批次中的大量菌体可以持续的进行多个批次的发酵，无需重复进行 种子的制作。同时，采用连续发酵培养工艺生产乳酸时，由于在接种 于新鲜发酵液时的接种量较大，可以使发酵罐中本菌的含量始终保持 较高浓度，从而可使整个发酵系统抵御杂菌污染的能力大大增强，以 至于发酵过程可以采取开放式发酵。[0006]同时，目前大规模L‑乳酸发酵生产工艺在发酵结束时，发酵液 中的残糖指标较高，约为0.5％，较高的残糖在提取时会导致收率下 降，能耗增加，产品理化指标降低等问题。

[0007]因此，本领域技术人员致力于开发一种连续零糖发酵生产L‑乳 酸的方法，以简化操作、缩短生产时间、降低生产成本。

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发明内容

[0008]针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种凝结芽孢 杆菌及利用其制备L‑乳酸的方法。本发明提供的凝结芽孢杆菌可以 以多种物质作为发酵碳源，通过分批发酵方法或连续发酵方法，具有 单批次发酵时间短，总发酵时间长的优点，发酵能力强，可以得到碳 源残余量极低甚至为零的发酵液，发酵液中L‑乳酸浓度高，且纯度 极高。[0009]为达此目的，本发明采用以下技术方案：[0010]第一方面，本发明提供了一种凝结芽孢杆菌，所述凝结芽孢杆菌 具有如SEQ ID No:1所示核苷酸序列的16s rRNA。

[0011]作为本发明的一种优选技术方案，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢 杆菌(Bacillus coagulans)FYLR2，于2020年7月28日保藏于中国 典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号

 M2020371。为CCTCC

[0012]本发明提供的凝结芽孢杆菌于2020年7月28日保藏于布达佩斯 条约指定的微生物国际保藏单位：中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection)，地址：湖北省武汉市武昌区八一 路299号武汉大学校内；通过16s rRNA基因分析，可知该菌株为凝 结芽孢杆菌。

[0013]本发明的所述凝结芽孢杆菌能够利用葡萄糖、核糖、半乳糖、果 糖、甘露糖、α‑甲基‑D‑葡萄糖甙、N‑乙酰‑葡糖胺、麦芽糖、蜜二糖、 蔗糖、棉子糖、淀粉等作为碳源。[0014]第二方面，本发明提供了第一方面所述的凝结芽孢杆菌在制备 L‑乳酸中的应用。[0015]第三方面，本发明提供了一种L‑乳酸的制备方法，利用第一方 面所述的凝结芽孢杆菌发酵制备L‑乳酸。

[0016]本发明所述制备方法为分批发酵方法或连续发酵方法。

[0017]本发明提供的所述凝结芽孢杆菌既可以满足分批发酵方式，又可 以满足连续发酵方法。

[0018]本发明所述分批发酵方法包括以下步骤：将种子培养液接入发酵 培养基中进行发酵培养，得到含有L‑乳酸的发酵液，所述发酵培养 的时间≤36h，优选为20～30h，例如20h、21h、22h、23h、24h， 25h、26h、27h、28h、29h、30h等。[0019]作为本发明的一种优选技术方案，所述分批发酵方法包括以下步 骤：[0020](1)活化第一方面所述的凝结芽孢杆菌；[0021](2)制备种子培养液；[0022](3)将种子培养液接入发酵培养基中进行发酵培养，得到含有 L‑乳酸的发酵液，所述发酵培养的时间≤36h，优选为20～30h，例 如20h、21h、22h、23h、24h，25h、26h、27h、28h、29h、30 h等。[0023]利用本发明的凝结芽孢杆菌可以实现在20‑30小时的较短单罐发 酵周期内的分批发酵，大大节约了发酵时间，并且能够实现在20～30 小时的较短单罐发酵周期内碳源残余量接近0，优选地，碳源残余量 ≤0.02％，更优选地碳源残余量为0％。[0024]本发明所述的“碳源残余量”指的是发酵完成后得到的发酵液中 碳源的含量与发酵液的质量体积比，用“％”表示。[0025]利用本发明提供的分批发酵方法最后得到的发酵液中，碳源残余 量极低甚至为零，提高了L‑乳酸的理化指标，其纯度极高，产量也 较高，并且能耗较低。

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在本发明所述的发酵培养时间范围内(36h以内，甚至在20～30 h之内)，本发明就

已经可以实现发酵液中的碳源残余量≤0.02％。

[0027]本发明提供的凝结芽孢杆菌还可以用于连续发酵，本发明所述连 续发酵方法包括如下步骤：将种子培养液接入发酵培养基中进行连续 发酵培养，得到多批次含有L‑乳酸的发酵液，

[0028]在连续发酵中，当前发酵装置中乳酸产量为110～160g/L时，优 选120～150g/L时，和/或葡萄糖浓度为30～90g/L，优选35～80g/L 时，取出10～40vol％的发酵液接种到后续的发酵装置中进行后续的 连续发酵。[0029]在取出10～40vol％的发酵液后，当前发酵装置中继续发酵至碳 源残余量接近0，优选地，低于0.02％，更优选地为0％。

[0030]作为本发明的一种优选技术方案，所述连续发酵方法包括以下步 骤：[0031](1)活化第一方面所述的凝结芽孢杆菌；[0032](2)制备种子培养液；[0033](3)将种子培养液接入发酵培养基中以连续发酵的方式进行发 酵培养至生产速率明显下降，得到多批次含有L‑乳酸的发酵液。[0034]作为本发明的一种优选技术方案，所述连续发酵包括以下步骤： 当发酵液中乳酸产量为110～160g/L时，优选120～150g/L时，和/ 或葡萄糖浓度为30～90g/L，优选35～80g/L时，取出10～40vol％ 的发酵液接种到后续的发酵装置中进行后续的连续发酵，当前发酵装 置中继续发酵至碳源残余量接近0，优选地，低于0.02％，更优选地 为0％(至碳源耗尽)。

[0035]本发明提供的凝结芽孢杆菌的活性较好，利用其进行连续发酵， 其发酵总时间在30小时至～180天的范围内，最高可达180天，而 且直至180天所有批次的所有发酵指标都不低于出发菌种发酵指标 的90％，而且能够实现碳源残余量接近0，优选地，≤0.02％，更优选 地为0％。本发明在实现“零糖”发酵的同时保证了L‑乳酸具有较高 的收率，并且降低了能耗，提高了产物L‑乳酸的理化指标。这对于 工业生产来说尤为重要，获得了预料之外的效果。

[0036]每罐从接入菌种液至葡萄糖耗尽放罐的过程称为一个单罐发酵 周期，发酵总时间为从接入种子培养液开始，直至整批次发酵结束的 时间。采用连续发酵，利用本发明的凝结芽孢杆菌可以实现长达180 天的连续发酵，而且，所有批次的所有发酵指标都不低于出发菌种指 标的90％。这对于工业生产来说尤为重要，获得了预料之外的效果。[0037]本发明所述菌种指标具体为：单批次周期≤36h，L‑乳酸浓度 ≥180g/L，转化率≥0.9g/g，光学纯度≥99.8％，碳源残余量≤0.02％。

[0038]本发明提供的利用本发明所述的凝结芽孢杆菌制备L‑乳酸的方 法可以实现“零糖”发酵，且连续发酵方法可以实现发酵连续生产 L‑乳酸。[0039]在连续发酵过程中，当生产检测结果明显下降时，停止发酵，所 述生产检测结果明显下降表现为：连续三批次单批次周期≥36h，L‑ 乳酸浓度≤162g/L，转化率≤0.85g/g，光学纯度＜99.5％或碳源残余量 ≥0.02％中的任意一种或至少两种的组合。[0040]在本发明提供的L‑乳酸的制备方法中，分批发酵和连续发酵均 需控制发酵温度，本发明的发酵培养的温度为40～60℃，例如45℃、50℃、55℃等，在此温度范围内发酵，可以

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省略对发酵培养基灭菌的 步骤。

[0041]在本发明提供的L‑乳酸的制备方法中，分批发酵和连续发酵均 需将培养基的pH值控制在5.5～7.5，优选将培养基的pH值控制在 6.0～7。

[0042]本发明用于控制pH值的中和剂为碳酸钙或氢氧化钙，优选地， 碳酸钙浓度为300～600g/L，例如300g/L、400g/L、500g/L等，氢 氧化钙浓度为200～400g/L，例如250g/L、300g/L、350g/L等。

[0043]无论是分批发酵方法还是连续发酵方法，本发明所述的活化、制 备种子培养液以及步骤(3)的发酵培养的方法均可以选择目前常规 的凝结芽孢杆菌的活化、种子培养、发酵的方法。

[0044]对于菌株活化：可以采用斜面培养法，在此进行举例说明：将凝 结芽孢杆菌FYLR2接种于斜面培养基上，50～60℃条件下，培养24 ～48h；优选地，将凝结芽孢杆菌FYLR2接种于含有20g/L琼脂的 固体斜面培养基上，50～60℃条件下，培养18～36h。[0045]本发明所述的斜面培养所用的斜面培养基可以为如下培养基：每 升中含有：葡萄糖10～60g，酵母粉5～10g，蛋白胨2～5g，碳酸 钙20～40g，纯化琼脂粉15～30g，余量为水，优选含有：葡萄糖 40g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，碳酸钙20g/L，纯化琼脂粉20 g/L，余量为水；该培养基的pH约为6.5。[0046]对于种子培养：将斜面培养物接种到种子培养基中，加入碳酸钙 控制发酵液pH，50～60℃条件下，静置培养10～24h，制备种子培 养液；转接入发酵罐中，45～60℃，60～150rpm，培养10～20h， 制得发酵罐种子培养液。优选地，种子培养为：将经过斜面培养的凝 结芽孢杆菌在无菌条件下接种到20～40mL种子培养基中，50～60℃ 条件下，加入中和剂维持pH为5.5～6.5条件下，静置培养15～24h； 以10vol％接种量同样条件扩增到200～400mL后全部转入含2～3L 种子培养基的5L发酵罐中，50～60℃，60～100rpm，加入中和剂维 持发酵液pH为6～7，在此条件下培养10～20h，制得发酵罐种子培 养液。[0047]本发明的种子培养基进行示例性列举如下：每升中含有：葡萄糖 40～80g，酵母粉5～10g，蛋白胨2～5g，碳酸钙20～40g，余量 为水，优选含有：葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，碳 酸钙20g/L，余量为水；该培养基的pH约为6.5。[0048]对于步骤(3)的发酵培养：环境参数等条件均可以采用目前现 有的利用其它凝结芽孢杆菌的发酵培养条件，本发明在此进行示例性 的列举：[0049]发酵培养方法为：将发酵罐种子培养液接入发酵培养基中，在 40～60℃环境下，控制pH为6～7进行发酵，优选按10～40vol％的 接种量接入发酵罐发酵培养基中；其中，温度优选50～55℃，接种量 优选20～25vol％。[0050]本发明的发酵培养基中包括碳源，氮源和用于维持发酵培养基 pH的中和剂，本发明的发酵培养基的各组分的添加量为目前常规的 添加量。[0051]本发明提供的凝结芽孢杆菌对多种碳源有效，包括但不限于葡萄 糖，本发明所述发酵培养基中的碳源选自核糖、半乳糖、葡萄糖、果 糖、甘露糖、α‑甲基‑D‑葡萄糖甙、N‑乙酰‑葡糖胺、麦芽糖、蜜二糖、 蔗糖、棉子糖或淀粉中的任意一种或至少两种的组合。[0052]本发明对氮源也进行了调整，所述发酵培养基中的氮源包括酵母 粉、硫酸铵或磷酸氢二铵中的任意一种或至少两种的组合，优选包括 酵母粉、硫酸铵和磷酸氢二铵的组合，进一步优选包括酵母粉0.2～10 g/L，硫酸铵2～20g/L，磷酸氢二铵0.1～10g/L。

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作为一种具体实施方式，本发明所用的发酵液培养基的组成成分 包括：葡萄糖

100～250g/L，酵母粉0.2～10g/L，磷酸氢二铵0.1～10g/L，磷酸氢二钾1～5g/L，磷酸二氢钾1～5g/L，硫酸铵2～20 g/L，氯化钠1～3g/L，氯化铁0.1～1g/L，生物素20～200ppm，维 生素B1 20～200ppm余量为水；进一步优选包括：葡萄糖100～250 g/L，酵母粉0.2～6g/L，磷酸氢二铵0.1～8g/L，磷酸氢二钾1～5g/L， 磷酸二氢钾1～5g/L，硫酸铵5～15g/L，氯化钠1～3g/L，氯化铁 0.1～1g/L，生物素20～200ppm，维生素B1 20～200ppm余量为水。[0054]对于本发明得到的L‑乳酸的发酵液，本发明还提供了L‑乳酸的 提取方法，优选地，本发明利用蒸馏提取的方法从含有L‑乳酸的发 酵液中得到L‑乳酸。[0055]作为本发明的一种优选技术方案，所述蒸馏提取的方法包括：[0056]对含有L‑乳酸的发酵液进行酸解、提纯、浓缩和分子蒸馏提纯， 得到所述L‑乳酸。[0057]对于本发明的酸解，为目前常规的酸解方法，示例性的列举：在 在60‑90℃温度下的发酵液中缓慢滴加硫酸进行酸解，然后固液分离， 得到含有L‑乳酸的酸解滤液。[0058]对于本发明所述的提纯，本发明不止选用活性炭进行简单的脱 色，本发明所述提纯的方法包括：经酸解得到的酸解液通过阳离子交 换、阴离子交换以及活性炭脱色，得到提纯液。

[0059]作为本发明的一种优选技术方案，本发明所述提纯包括：含L‑ 乳酸的酸解滤液通入阳离子交换柱和阴离子交换柱，然后再将其利用 活性炭脱色。[0060]对于本发明的浓缩和分子蒸馏提纯，目前现有技术中任何适用于 本发明的浓缩和分子蒸馏提纯均可采用，本发明不进行过多描述。[0061]作为本发明的一种具体实施方式，本发明所述的含有L‑乳酸的 发酵液蒸馏提纯乳酸的方法如下：[0062]A、取L‑乳酸发酵液加热至80℃，缓慢加硫酸进行酸解至 pH＝1.72，经固液分离得到含L‑乳酸的酸解滤液；[0063]B、将步骤A获得的含L‑乳酸的酸解滤液依次通入阳离子交换柱 和阴离子交换柱，收集得到含L‑乳酸的离交液，再将含L‑乳酸的离 交液经活性炭脱色，获得较纯净的含L‑乳酸的溶液；[0064]C、得到含L‑乳酸 的浓缩溶液；将步骤B得到的L‑乳酸溶液经进一步浓缩，[0065]D、将步骤C得到的含L‑乳酸浓缩溶液经分子蒸馏提纯，得到符 合食品级及以上级别的L‑乳酸成品。

[0066]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：[0067](1)利用本发明提供的凝结芽孢杆菌制备L‑乳酸可以采用分批 发酵方法，采用分批发酵的方法，单批得到的发酵液中L‑乳酸的产 量在170g/L以上，生产速率在5.5g/L/h以上，发酵时间可以控制在 36h以内，甚至是24h以内，光学纯度可达99.4％以上，转化率在 0.85g/g以上，发酵结束后碳源残余量低于0.02％，甚至碳源残余量 可以为0；[0068](2)本发明在具体实施方式中，单批次得到的发酵液最优可达 到L‑乳酸的产量在170g/L以上，生产速率在7.3g/L/h以上，发酵时 间在25h以内，光学纯度可达99.5％以上，转化率在0.87g/g以上， 发酵结束后碳源残余量接近0或者为0，实现“零糖”；[0069](3)利用本发明提供的凝结芽孢杆菌制备L‑乳酸还可以采用连 续发酵的方法，采用连续发酵的方法，其发酵总时间最长可达180天 以上，每批次得到的发酵液均可保证发

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酵周期≤36h，生产速率在5.5 g/L/h以上，最高可达7.3g/L/h，L‑乳酸浓度≥170g/L，转化率≥0.85g/g， 光学纯度≥99.5％，碳源残余量≤0.02％，最优可实现“零糖”；[0070](4)本发明提供的连续发酵的方法发酵过程简单经济，高效环 保，并且每批次发酵周期短，总发酵时间长，可以在节约成本的同时 提高生产效率；[0071](5)本发明提供的凝结芽孢杆菌不仅可以实现较短时间内的分 批发酵，还同时可以实现长达180天的连续发酵，而且两种发酵方式 均可以实现生产速率在5.5g/L/h以上，最高可达7.3g/L/h，L‑乳酸浓 度≥170g/L，转化率≥0.85g/g，光学纯度≥99.4％，碳源残余量≤0.02％， 最优可实现“零糖”的发酵指标；[0072](6)本发明提供的凝结芽孢杆菌在进行连续发酵中在取出10～ 40vol％的发酵液后，无需在当前发酵装置中进行碳源的补料，也可 以在节约成本的同时提高生产效率；[0073](7)本发明提供的凝结芽孢杆菌因为在40～60℃的温度下进行 发酵，因此，可以不对发酵培养基进行灭菌。

具体实施方式

[0074]下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域 技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应 视为对本发明的具体限制。[0075]性能测试方法：[0076]利用下述测试方法对下述实施例提供的发酵液进行性能测试，方 法如下：[0077](1)葡萄糖含量(g/L)的测定：发酵液稀释到所需浓度范围后离 心，采用生物传感分析仪SBA‑40D(山东省科学院)测定；[0078](2)乳酸含量(g/L)的测定：采用Agilent 1200液相色谱仪，色 谱柱型号：87H(300×7.8mm)，具体操作条件为：0.005mol/L硫酸 作为流动相，流速0.5mL/min，进样量20μL，柱温60℃，使用RID 为检测器，检测器工作温度35℃；利用L‑乳酸标准品做出标准曲线， 再根据标准曲线计算出发酵液中乳酸的含量；[0079](3)光学纯度：采用Agilent 1200液相色谱仪，色谱柱型号： CRS10W；具体操作条件为：2mmol/L硫酸铜作为流动相，流速0.5 mL/min，进样量20μL，柱温35℃，利用L‑乳酸和D‑乳酸做标准品， 其中，作为标准品的D‑乳酸为德国Sigma‑Aldrich公司的产品，其货 号为L0625‑25 mg；作为标准品的L‑乳酸为德国Sigma‑Aldrich公司 的产品，其货号为46937‑500mg。分析得到试样中L‑乳酸和D‑乳酸 的峰面积值，以面积归一化法定量，并按以下公式计算样品中L‑乳 酸的光学纯度：

[0080]

公式中，AL为L‑乳酸峰面积值，AD为D‑乳酸峰面积值；[0082](4)L‑乳酸发酵生产能力(g/L/h)：L‑乳酸产量(g/L)÷发酵时间 (h)。[0083]实施例1

[0084]本实施例提供了一种凝结芽孢杆菌FYLR2，保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2020371，其16s rRNA序列如 序列表SEQ ID No:1所示。[0085]实施例2

[0081]

9

CN 112694993 A[0086]

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本实施例提供了一种利用实施例1提供的凝结芽孢杆菌于50L 发酵罐中制备L‑乳

酸的分批次发酵的方法。

[0087]本实施例使用的培养基组成如下：[0088]斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，碳 酸钙20g/L，琼脂粉20g/L，pH为6.0；[0089]种子培养基：葡萄糖80g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，碳 酸钙40g/L，pH为6.0；[0090]发酵培养基：葡萄糖220g/L，酵母粉0.5g/L，磷酸二氢钾2.3g/L， 磷酸氢二钾1.15g/L，硫酸铵15g/L，氯化钠1g/L，磷酸氢二铵0.5g/L， 氯化铁0.3g/L，生物素50ppm，维生素B1 50ppm，余量为水；所述 发酵培养基的pH为6.0，115℃条件下灭菌20分钟；[0091]制备方法如下：[0092](1)斜面培养：将凝结芽孢杆菌FYLR2接种于斜面培养基上，55℃条件下培养30h。[0093](2)种子培养：将步骤(1)的斜面培养物，在无菌条件下接种 到30mL种子培养基中，加入40g/L碳酸钙控制发酵液pH，55℃条 件下，静止培养17h；以10vol％转接入300mL种子培养基中，用相 同方法培养；以10vol％转接入含2.5L种子培养基的5L发酵罐中， 55℃、80rpm，用25％(w/v)的氢氧化钙溶液维持发酵液pH为6.2， 在此条件下培养17h，制得种子培养液；[0094](3)发酵培养：将步骤(2)制得的种子液以25vol％的接种量 接种于12L发酵培养基中，50℃、80rpm，用25％(w/v)的氢氧化 钙溶液维持发酵液pH为6.2，在此条件下发酵至葡萄糖耗尽，发酵 结束。[0095](4)根据上述检测和计算方法，检测发酵液中L‑乳酸浓度和残 留葡萄糖浓度，计算L‑乳酸生产速率；[0096]实施例3

[0097]本实施例提供了一种利用实施例1提供的凝结芽孢杆菌于50L 发酵罐中制备L‑乳酸的分批次发酵的方法。

[0098]与实施例2的区别在于，本实施例的发酵培养基为：玉米糖化液 总糖220g/L，酵母粉0.5g/L，磷酸二氢钾2.3g/L，磷酸氢二钾1.15g/L， 硫酸铵15g/L，氯化钠1g/L，磷酸氢二铵0.5g/L，氯化铁0.3g/L， 生物素50ppm，维生素B1 50ppm，余量为水；所述发酵培养基的 pH为6.2，115℃条件下灭菌20分钟。

[0099]实施例2和实施例3的测试结果见表1：[0100]表1

[0101]

由实施例2‑3和性能测试可知，本发明提供的凝结芽孢杆菌可以 用于制备L‑乳

酸，采用单批次发酵的方法，其生产能力最优可达7.3 g/L/h，发酵时间最优可在24h内完成，最后的葡萄糖残余量为0， 真正实现了碳源残余量为0。

[0102]

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CN 112694993 A[0103]

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实施例4

[0104]本实施例提供了一种利用实施例1提供的凝结芽孢杆菌于50L 发酵罐中制备L‑乳酸的连续发酵的方法。

[0105]与实施例2的区别如下：[0106]a、每2h取样一次，测定发酵液中的残糖量和L‑乳酸浓度，当 葡萄糖浓度降到50g/L时，取出35vol％的发酵液进行后续的连续发 酵，当前发酵罐中的料液继续发酵直至发酵罐中的葡萄糖耗尽；[0107]b、重复步骤(3)10次，最后一批次发酵过程中不再取出发酵 液，发酵至葡萄糖耗尽；

[0108]随机抽取实施例4的部分批次的发酵结果见表2：[0109]表2

[0110]

实施例5

[0112]本实施例提供了一种利用实施例1提供的凝结芽孢杆菌于100 m3发酵罐中制备L‑乳酸的连续发酵的方法。

[0113]本实施例使用的培养基组成如下：[0114]斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，碳 酸钙20g/L，琼脂粉20g/L，pH为6.0；[0115]种子培养基：葡萄糖80g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，碳 酸钙40g/L，pH为6.0；[0116]发酵培养基：玉米糖化液总糖220g/L，酵母粉0.5g/L，磷酸二 氢钾2.3g/L，磷酸氢二钾1.15g/L，硫酸铵15g/L，氯化钠1g/L，磷 酸氢二铵0.5g/L，氯化铁0.3g/L，生物素50ppm，维生素B1 50ppm， 余量为水；所述发酵培养基的pH为6，115℃条件下灭菌20分钟；[0117]制备方法如下：[0118](1)斜面培养：将凝结芽孢杆菌FYLR2接种于斜面培养基上， 50℃条件下，培养48h；[0119](2)种子培养：将步骤(1)的斜面培养物，在无菌条件下接种 到30mL种子培养基中，加入40g/L碳酸钙控制发酵液pH，50℃条 件下，静止培养24h，制得种子培养液1；以10vol％将种子培养液1 转接入300mL种子培养基中，用相同方法培养，制得种子培养液2； 以10vol％将种子培养液2转接入含3L种子培养基的5L发酵罐中， 50℃、60rpm，用30％(w/v)的氢氧化钙溶液维持发酵液pH为6， 在此条件下培养15h，制得种子培养液3；继续以相同方式扩大种子 培养，得到18m3种子培养液；

[0111]

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CN 112694993 A[0120]

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(3)发酵培养：将步骤(2)制得的种子培养液以30vol％的接 种量接种于发酵培养

基中，48℃、100rpm，用30％(w/v)的氢氧化 钙溶液维持发酵液pH为7，培养期间，每2h取样一次，测定发酵 液中的残糖量和L‑乳酸浓度，当乳酸浓度为150g/L时，取出25vol％ 的发酵液进行后续的连续发酵，当前发酵罐中的料液继续发酵直至发 酵罐中的葡萄糖耗尽；[0121](4)发酵结束：重复步骤(3)10次，最后一批次发酵过程中 不再取出发酵液，发酵至残糖接近于0；

[0122]随机抽取实施例5部分批次的发酵结果见表3：[0123]表3

[0124]

实施例6

[0126]本实施例提供了一种利用实施例1提供的凝结芽孢杆菌于800 m3发酵罐中制备L‑乳酸的连续发酵的方法。

[0127]本实施例使用的培养基组成如下：[0128]斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，碳 酸钙20g/L，琼脂粉20g/L，pH为6.0；[0129]葡萄糖80g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，碳 酸钙40g/L，pH为6.0；种子培养基：[0130]发酵培养基：葡萄糖220g/L，酵母粉0.5g/L，磷酸二氢钾2.3g/L， 磷酸氢二钾1.15g/L，硫酸铵15g/L，氯化钠1g/L，磷酸氢二铵0.5g/L， 氯化铁0.3g/L，生物素50ppm，维生素B1 50ppm，余量为水；所述 发酵培养基的pH为6，115℃条件下灭菌20分钟；[0131]制备方法如下：[0132](1)斜面培养：将凝结芽孢杆菌FYLR2接种于斜面培养基上， 50℃条件下，培养48h；[0133](2)种子培养：将步骤(1)的斜面培养物，在无菌条件下接种 到30mL种子培养基中，加入40g/L碳酸钙控制发酵液pH，50℃条 件下，静止培养24h，制得种子培养液1；以10vol％将种子培养液1 转接入300mL种子培养基中，用相同方法培养，制得种子培养液2； 以10vol％将种子培养液2转接入含3L种子培养基的5L发酵罐中， 50℃、60rpm，用30％(w/v)的氢氧化钙溶液维持发酵液pH为6， 在此条件下培养15h，制得种子培养液3；继续以相同方式扩大种子 培养，得到180m3种子培养液；[0134](3)发酵培养：将步骤(2)制得的种子培养液以30vol％的接 种量接种于发酵培养基中，48℃、100rpm，用30％(w/v)的氢氧化 钙溶液维持发酵液pH为7，培养期间，每2h取样

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[0125]

CN 112694993 A

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一次，测定发酵 液中的残糖量和L‑乳酸浓度，当乳酸浓度为150g/L时，取出25vol％ 的发酵液进行后续的连续发酵，当前发酵罐中的料液继续发酵直至发 酵罐中的葡萄糖耗尽；[0135](4)发酵结束：重复步骤(3)10次，最后一批次发酵过程中 不再取出发酵液，发酵至葡萄糖耗尽；

[0136]随机抽取实施例6部分批次的发酵结果见表4：[0137]表4

[0138]

由实施例4‑6和性能测试可知，本发明提供的凝结芽孢杆菌可以 用于制备L‑乳

酸，采用连续发酵的方法，每批次的发酵时间均在31h 以内，生产速率可达5.8g/L/h以上，L‑乳酸浓度≥170g/L，转化率≥0.85 g/g，光学纯度≥99.5％，残糖在0.1％以下，基本可实现“零糖”发酵。[0140]实施例7

[0141]本实施例提供了一种利用实施例1提供的凝结芽孢杆菌于100 m3发酵罐中制备L‑乳酸的连续发酵的方法。

[0142]与实施例5的区别在于，本实施例步骤(4)为：重复步骤(3) 至生产速率明显下降，最后一批次发酵过程中不再取出发酵液，发酵 至葡萄糖耗尽；[0143]其中，生产速率明显下降为：连续三批次单批次周期≥36h，L‑ 乳酸浓度≤162g/L，转化率≤0.85g/g，光学纯度≤99.5％或碳源残余量 ≥0.05％中的任意一种或至少两种的组合；

[0144]随机抽取实施例7部分批次的发酵结果见表5：[0145]表5

[0139]

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[0146]

每罐从接入种液至葡萄糖耗尽放罐的过程称为一个单罐发酵周 期，发酵总时间

为从接入种子培养液开始，直至整批次发酵结束的时 间。[0148]在本实施例中，从第一罐发酵罐接入种子培养液开始，每一罐的 运行时间均在22‑31h以内，此时，L‑乳酸的浓度均可达175g/L以 上，从正在运行的发酵罐种中向新的培养基发酵罐中接种，如此循环 直至当生产速率明显下降，完成发酵，本实施例共计发酵180批次， 每批次时间在22‑31h以内，即本发明提供的凝结芽孢杆菌进行连续 发酵总发酵时间可达180天以上。[0149]实施例8

[0150]本实施例提供了一种从L‑乳酸发酵液中蒸馏提取乳酸的方法。[0151](1)取10.0kg实施例2提供的L‑乳酸发酵液(酸度19.5％(m/m)、 残糖0％)加热至80℃，缓慢加硫酸进行酸解至pH＝1.72，经固液分离 得到10.55kg(酸度为18.2％(m/m))含L‑乳酸的酸解滤液；[0152](2)将步骤(1)获得的含L‑乳酸的酸解滤液依次通入阳离子 交换柱和阴离子交换柱，收集得到10.82kg(酸度为17.4％(m/m)、 Ca2+10ppm、SO42‑4ppm)含L‑乳酸的离交液，再将含L‑乳酸的离交 液经活性炭脱色，获得较纯净的含L‑乳酸的溶液11.35kg(酸度为 16.5％(m/m)、色度35Hazen)；[0153](3)将步骤(2)得到的L‑乳酸溶液经进一步浓缩，得到2.86kg (酸度65.1％(m/m))含L‑乳酸的浓缩溶液；[0154](4)将步骤(3)得到的含L‑乳酸浓缩溶液经分子蒸馏提纯， 得到1.96kg(酸度88.6％(m/m))符合食品级的L‑乳酸成品，其中分子 蒸馏蒸出率为93.5％。

[0147]

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CN 112694993 A[0155][0156][0157]

说　明　书

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对比例1

本对比例提供了一种从L‑乳酸发酵液中蒸馏提取乳酸的方法。与实施例8的区别在于，本对比例中的L‑乳酸发酵液酸度为 18.4％(m/m)，残糖

0.2％。

经过步骤(1)～(4)，得到1.85kg(酸度85.2％(m/m))符合食品 级的L‑乳酸成品，

分子蒸馏蒸出率仅为89.2％。

[0159]由实施例8和对比例1的对比可知，利用本发明的凝结芽孢杆菌 制备得到的L‑乳酸发酵液中的“残糖”极低，甚至为0，因此，在本 发明提供的L‑乳酸发酵液提取乳酸时，分子蒸馏蒸出率较高，可达 93％以上，提高了生产效率，降低了能耗，而采用“残糖量”较高的 L‑乳酸发酵液提取乳酸会导致乳酸产率下降，增加能耗。[0160]虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发 明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

[0158]

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序　列　表

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SEQUENCE LISTING<110> 安徽丰原集团有限公司<120> 一种凝结芽孢杆菌及利用其制备L‑乳酸的方法<130> RYP2010970.9<160> 1<170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 1535<212> DNA<213> Bacillus coagulans

 1<400>

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgtgc 60

 aaagcttgct tttaaaaggt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggc 120ggacctttta

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