实验八 细胞生物学设计性实验
实验目的、方法步骤、实验要求、注意事项、备选实验、自选实验
一、实验目的
训练学生查阅文献，灵活运用所学知识和技能设计实验，完成实验，以培养学生发现问题、分析问题和解决某一问题的能力，培养学生的创新意识和创新能力。部分优秀的研究论文可进一步深化、充实，作为毕业论文内容。
二、方法步骤
（一）选题
实验以3-4人为一组，由教师命题或自行选题，查阅文献，灵活运用所学知识和技能设计实验（教师介绍实验室所具备的实验条件，明确选题的范围，指导学生选题）。
（二）设计实验
查阅文献后，以小组为单位讨论，制定出详细的实验方案，包括实验目的、基本原理、所有的实验材料与用量、实验药品与用量、仪器设备、器具与数量、实验方法与步骤（实验测试手段要建立在自已的认知水平上），交教师审阅、修改、完善(实验方案要在实验前2-3周交给老师审阅)。
（三）实施实验
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1．根据实验设计，进行实验准备工作，包括试剂的配制、实验器具和实验材料的准备（本人难于解决的实验材料可在实验前与教师商量解决）。
2．按实验设计的方法步骤，完成实验的全过程，并做详细的实验记录。
3．实验操作时间共3-4周
（四）实验小结
实验报告以论文的形式写作，内容包括摘要、关键词、前言、材料与方法、实验结果与分析（或讨论）、结论、参考文献等几部分。写作格式可参照深圳大学学报(自然科学版)或其他学报(征稿启示对写作格式都有详尽要求)，论文要用电脑打印后递交（并提交电子文档）。
实验效果的考核测评方法
考核将由4部分构成：（1）实验方案30%；（2）实验论文50%；（3）心得交流10%；（4）遵守制度、出勤率、实验态度等情况10%。
三、实验要求
1）实验方案完成后交老师审阅，经老师改进认可后方可进行。
2)由于实验室设备、经费、药品购买时限等客观因素限制，要求同学们设计的实验研究内容不超出细胞生物学实验指导范畴，实验设计不必过于繁而在于巧，新颖和有创意(可上网或用其他手段查阅相关资料作参考)，同时，要求设计具有一定的科学性、理论性。
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3) 实验中请自觉遵守学院规章制度，首先进入实验室要登记，其次仪器用完要登记。做到爱护仪器，节省材料与药品。实验完毕及时清洁整理用过的实验用具并如数放回原位，自觉维护实验室的安全与卫生。
4）每班成立一个以班长负责制的开放实验管理小组，配合教师完成下列工作：①实验前领用实验试剂及器具；②实验过程中实验室的水电、药品安全、仪器使用与登记情况、清洁卫生；③实验完成后整理实验室。
四、注意事项
实验设计的意义、三要素和六原则
（一）实验设计的意义
实验设计是科学研究计划内关于研究方法与步骤的一项内容。在科研工作中，在制订研究计划时，都应根据实验的目的和条件，结合统计学的要求，针对实验的全过程，认真考虑实验设计问题。一个周密而完善的实验设计，能合理地安排各种实验因素，严格地控制实验误差，从而用较少的人力、物力和时间，最大限度地获得丰富而可靠的资料。反之，如果实验设计存在着缺点，就可能造成不应有的浪费，且足以减损研究结果的价值。总之，实验设计是实验过程的依据，是实验数据处理的前提，也是提高科研成果质量的一个重要保证。
一般来说，完善的设计方案需具备以下几个条件：实验所需的人力、物力和时间资源；实验设计的“三要素”和“六原则”均符合专业和统计学要求，对实验数据的收集、整理、分析等有一套规范的规定和正确的方法。而其中准确把握统计研究设计的“三要素和六原
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则”，是科学实验设计的核心。
（二）实验设计的“三要素”
1）实验对象：实验所用的材料即为实验对象。如用小鼠做实验，小鼠就是本次实验的实验对象，或称为受试对象。实验对象选择的合适与否直接关系到实验实施的难度，以及别人对实验新颖性和创新性的评价。一个完整的实验设计中所需实验材料的总数称为样本含量。最好根据特定的设计类型估计出较合适的样本含量。样本过大或过小都有弊端。
2）实验因素，又称为被试因素：所有影响实验结果的条件都称为影响因素，实验研究的目的不同，对实验的要求也不同。影响因素有客观与主观，主要与次要因素之分。研究者希望通过研究设计进行有计划的安排，从而能够科学地考察其作用大小的因素称为实验因素（如药物的种类、剂量、浓度、作用时间等）；对评价实验因素作用大小有一定干扰性且研究者并不想考察的因素称为区组因素或称重要的非实验因素（如动物的窝别、体重等）；其他未加控制的许多因素的综合作用统称为实验误差。最好通过一些预实验，初步筛选实验因素并确定取哪些水平较合适，以免实验设计过于复杂，实验难以完成。
3） 实验效应：实验因素取不同水平时在实验单位上所产生的反应称为实验效应。实验效应是反映实验因素作用强弱的标志，它必须通过具体的指标来体现。要结合专业知识，尽可能多地选用客观性强的指标，在仪器和试剂允许的条件下，应尽可能多选用特异性强、灵敏度高、准确可靠的客观指标。对一些半客观（比如读pH试纸上的数值）或主观指标（对一些定性指标的判断上），一定要事先规定读取数值的严格标准，只有这样才能准确地分析自己的实验结果，从而也大大提高了自己实验结果的可信度。
（三）实验设计的“六原则”
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1）随机原则：即运用“随机数字表”实现随机化；运用“随机排列表”实现随机化；运用计算机产生“伪随机数”实现随机化。尽量运用统计学知识来设计自己的实验，减少外在因素和人为因素的干扰。
2）对照原则，包括空白对照和阳性对照：空白对照组的设立——只有通过对照的设立我们才能清楚地看出实验因素在当中所起的作用。当某些处理本身夹杂着重要的非处理因素时，还需设立仅含该非处理因素的实验组为实验对照组；历史或中外对照组的设立一一这种对照形式应慎用，其对比的结果仅供参考，不能作为推理的依据；多种对照形式同时并存。
3）重复原则，包括两层含义，即重现性和重复数：所谓重复原则，就是在相同实验条件下必须做多次独立重复实验。一般认为重复一定次数以上的实验才具有较高的可信度。
4） 均衡衡原则：一个实验设计方案的均衡性好坏，关系到实验研究的成败。应充分发挥具有各种知识结构和背景的人的作用，群策群力，方可有效地提高实验设计方案的均衡性。在实验设计的过程中要注意时间上的分配，只有在时间上分配好了，才不会出现一段时间特别忙而一段时间特别闲的情况。
5）弹性原则：所谓空格，指的是在时间分配图上留有空缺。适当的空缺是非常必要的，只有这样才能富有弹性的实施实验计划，并不断地调整好自己的实验进度。
6）最经济原则：不论什么实验，都有它的最优选择方案，这包括在资金的使用上，也包括人力时间的损耗上，必要时可以预测一下自己实验的产出和投入的比值，这个比值越大越好，当然是以你所拥有的实验条件作基础的
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五、备选实验：
我们提出的备选实验，是以现有教学与研究为基础，考虑到细胞学基本实验技术、实验室现有设备以及学生科研能力而提出的几个研究方面，局限性很大，只是想起到抛砖引玉、启发学生思维的作用。
1、新资源植物染色体制片技术及核型分析
实验材料：
某一新资源植物
实验目的：
进行植物染色体制片技术技能训练；熟习植物（或者动物）分裂细胞有丝分裂前、中、后、末期的染色体图象；掌握植物染色体显微照像技术及组型分析技术；结合实验，对某一新资源植物的染色体组型进行研究，获得该物种染色体组型公式类型、核型图及核型模式图；培养和提高学生的研究创新实验能力。
实验步骤：
分裂细胞→预处理→前低渗→酶去壁→后低渗→固定→制片→染色→观察→显微照相→配对翻拍→核型分析
仪器设备：
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普通生物显微镜、数码显微镜、计算机图象处理、恒温水浴锅
特殊药品：
秋水仙素、纤维素酶、果胶酶等
2、新资源动物染色体制片技术、分带及核型分析
实验材料：
某一新资源动物（比如涡虫）尽量选择目前没有相关染色体资料的物种
实验目的：
掌握动物外周血淋巴细胞或骨髓细胞染色体制片技术，或者利用其它染色体制备技术进行动物染色体制片技术技能训练；熟习动物分裂细胞有丝分裂前、中、后、末期的染色体图象，并尝试进行染色体分带；掌握动物染色体显微照像技术及组型分析技术，得出动物染色体组型模式公式及模型图；培养和提高学生的研究创新实验能力
实验步骤：
外周血淋巴细胞培养→预处理→低渗→固定→制片→染色→观察→显微照相→配对翻拍→核型分析
仪器设备：
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普通生物显微镜、NIKON数码显微镜、计算机图象处理、恒温水浴锅
特殊药品：
PHA（植物血球凝集素）、秋水仙素、培养基、小牛血清
3、植物多倍体诱变或理化诱变及其变异鉴定技术（暂不开展）
实验材料：
实验目的：
掌握植物r射诱变及多种化学诱变剂诱变综合处理技术及方法，进行人工诱变基因突变技能训练；掌握植物多倍体人工加倍方法及技术，进行人工多倍体诱变技能训练；掌握植物理化诱变人工鉴定及培育技术；r射线诱变后代能进行染色体结构变异观察诱变后代生物损伤、突变率观察鉴定及培育技术；掌握植物多倍体诱变变异人工鉴定及培育技术。掌握诱变后代染色体数目计数及诱变后代生物损伤及突变率观察、鉴定及培育技术。
实验步骤：
种子或幼芽→化学诱变设计→诱变→某突变性状鉴定→统计分析
仪器设备：
培养箱、电炉、烧杯、漏斗、量筒、天平
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特殊药品：
种子或幼芽→化学诱变设计→诱变→某突变性状鉴定→统计分析
4、涡虫干细胞（焰细胞）的观察、培养及利用染色体核型分析和分带
实验材料：三角涡虫或者其它种类
实验目的：观察涡虫的干细胞，探索其培养方法，利用细胞培养获得大量分裂相细胞，继而进行染色体核型分析，分带等，探索比较不同种类涡虫的进化地位。
仪器：倒置显微镜
特殊药品：PHA、培养基、秋水仙素、小牛血清
5、涡虫其它有关实验
涡虫的整体装片、形态观察、内部器官观察、神经系统的显示、生理活性物质的定位（神经肽、神经递质等）、NOS（一氧化氮合酶）的定位与显示、染色体制作、涡虫对水生生活环境的影响等。
6、水生动物黏液细胞的分布
研究背景：
黏液细胞是动物上皮组织中分泌黏液的腺体细胞，在水生动物的身体、鳃、消化道等
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的表面都有大量的分布，分泌的黏液中含有黏多糖、水解酶以及免疫球蛋白，起着润滑身体、减少阻力、凝集细菌、预防感染等多种作用。
黏液细胞可用AB－PBS染色进行特异性显示，在不同的pH下，不同类型的黏液细胞可以呈现不同的颜色。黏液细胞的类型、密度与动物的种类、生理状态、生长情况密切相关，对其深入开展研究，将会产生一定的理论意义和应用价值。
（1）查阅文献，确定研究题目和研究目标。
（2）研究技术的选择
1、石蜡切片
2、AB－PBS染色（即多糖的显示）
（3）确定技术路线和研究方案
建议选择尚未进行黏液细胞研究的养殖价值较大的种类开展研究，充分考虑养殖条件、季节、水质、发病情况等因素的影响。
7、利用染色体畸变与微核试验进行安全毒理评价和环境检测
研究背景：
当致畸性化学物质作用于细胞周期G1期和S期时，可以诱发染色体畸变，作用于G2期时，诱发染色单体畸变。染色体畸变后可出现断裂、数目改变等，在显微镜下可以观察
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到染色体片段、滞后染色体、微小体等。
微核是染色体体畸变的另一种表现形式，为有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体片断，在间期细胞的细胞质中形成的一个或多个圆形或杏仁状结构。微核游离于主核之外，大小在主核的1/3一下。其折光率及细胞化学反应和主核一样，也具有合成DNA的能力。
许多理化因素，如辐射、化学试剂等作用于分裂细胞而产生染色体畸变，形成微核。染色体畸变和微核可以直接利用人或者动物的细胞进行检测，是检测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害的一种比较理想的方法。已经证实，染色体畸变率和微核率同作用因子的剂量呈正相关，可应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、笑药试验、食品添加剂、环境检测的安全评价及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。
（1）查阅文献，确定研究题目和研究目标。
（2）研究技术的选择
动物：可选择人正常细胞或外周血培养淋巴细胞，也可以用小鼠进行体内试验，代测物质处理动物后，取骨髓细胞进行检测。
a)染色体畸变实验：参照实验教材，取材，制片，染色，显微镜观察染色体畸变。
b)微核试验：代测物质处理后，直接做细胞涂片，经染色体后显微镜观察。小鼠体内试验，须用代测物质处理动物后，取骨髓细胞进行检测。骨髓细胞中有核的细胞均出现微核，有的可能出现一个微核以上，仍按一个细胞计数。正常小鼠嗜多核细胞微核率为千分之五以下，超过改值则为异常。
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植物
可用蚕豆或洋葱根尖进行检测。用代测物质配成不同浓度的水溶液，培养蚕豆或洋葱根尖，利用压片技术（见教材）制作根尖压片。
（3）用环磷酰胺作为阳性对照。
8、生物活性物质对巨噬细胞吞噬及其酶活性的影响
研究背景：
在高等动物中，单核吞噬细胞系统和噬中性粒细胞专司吞噬功能，在细胞的非特异性免疫功能中发挥重要作用。单核吞噬细胞系统包括血液中的单核细胞和组织中固定和游走的巨噬细胞。
单核吞噬细胞具有吞噬和杀伤异物，呈递抗原、分泌介质等多种功能。但静息的巨噬细胞其分泌和杀伤功能均低下，只有活化的巨噬细胞才具有较强的吞噬能力，产生非特异抗感染和抗肿瘤作用。多糖、多肽等多种物质可以激活巨噬细胞，提高相关酶的活性，根据其作用强弱，可以评价其保健及药物开发价值。
（1）查阅文献，确定研究题目和研究目标。
（2）供试物质的选择：
微生物、动物、植物的成分以及其次生代谢物质、保健品、药物等。如益力多牛奶。
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（3）研究技术的选择
a) 供试物质的分离纯化技术，参考相关的工具书或参考文献
b)小鼠巨噬细胞吞噬实验，见实验教材。
c)酶细胞化学技术：酸性磷酸酶的显示，见教材。
（4）确定技术路线和研究方案
（5）阳性对照：建议选择已被公认的同类的活性物质作为阳性对照。
九、中药对肝脏的保护作用
研究背景：
在传统中有许多补肝保肝的单方与复方，但是，对它们的作用机理研究却明显不够。在正常生理状态下，细胞中的成分和维持正常生理活动的酶的活性相对稳定。但是在细胞受到损坏或不同的生理条件下，细胞中的成分就会发生变化。可以利用动物肝损伤模型，采用细胞学试验技术，测定肝细胞的脂肪、糖原、各种酶类等指标的变化，探讨相关重要的作用以及机理。
（1）查阅文献，确定研究题目和研究目标。
（2）供试中药的选择：
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a)临床上已明确疗效，但是其作用机理尚不清楚的中药。
b)补血、补气功能明确，保肝作用尚待研究和开发的中药。
（2）研究技术的选择
a)中药的炮制和处理
b)动物肝损伤模型的制备
i.小鼠肝脏酒精损伤模型的制备：选取健康的昆明小鼠若干，随机分组，并用不同浓度的乙醇进行灌胃处理，每天1～2次。四周后处死小鼠，取其肝组织进行组织切片，分析其受损情况。选取合适的浓度作为实验浓度，用于建立小鼠肝酒精损伤模型。
ii.小鼠肝损伤模型的制备：腹腔注射0.1%的四氯化碳花生油溶液10mL/kg。
c)动物肝组织脂肪、糖原、各种酶的显示及H.E染色方法见教材。
（3）确定技术路线和研究方案
（4）阳性对照：建议选择保肝药物作为阳性对照。
注意事项：本实验步骤繁多，耗时较长。
十、多糖对淋巴细胞转化的影响
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研究背景：体外培养的T细胞在有丝分裂原或特异性抗原刺激下可以转化呈淋巴母细胞，其转化率可以反映机体T细胞的细胞免疫功能，已广泛用于免疫缺陷病、白血病、肿瘤等的研究。
淋巴细胞转化实验的基本原理：T细胞在体外培养时，如收到非特异性抗原（如植物血球凝集素－ＰＨＡ或半刀豆蛋白－ConA）或特异性抗原的刺激，可转化为淋巴母细胞，并进行有丝分裂。转化的淋巴母细胞呈现不成熟的母细胞形态，以及蛋白质和核酸合成的增加。淋巴母细胞转化率或核酸合成增加的程度反映了T细胞对刺激物的应答水平。淋巴细胞转化试验可用形态学检测法、MTT比色法和3H标记胸腺嘧啶核苷渗入法进行测定。
淋巴细胞转化试验是检测功能性食品和药物的细胞免疫功效的法定指标，在保健品和药物的研制与开发中有着重要价值。今年来，多糖的保健作用日益受到人们的重视，研制和开发多糖类保健品和药品，成为食品和医药研究的热点领域。
1）查阅文献，确定研究题目和研究目标。
(2)供试多糖的选择
各种真菌多糖、植物多糖和动物多糖
(3)研究技术的选择
a)多糖的提取与纯化
i. 取材，粉碎或匀浆
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ii. 热水提取
iii. 乙醇沉淀
iv. 去蛋白
v. 脱水干燥
b) 研究可采用体内法，也可以采用体外法
i. 体内法用代测多糖饲喂小鼠或大鼠，然后去淋巴细胞体外培养，测定淋巴细胞转化率，分析多糖的免疫效果。
ii. 体外法是取动物或人的外周血淋巴细胞进行体外培养，然后向培养液中加入不同剂量的多糖，培养一段时间后，测定淋巴细胞的转化率，分析多糖的免疫效果。
c) 淋巴细胞转化的测定建议选择MTT比色法（需要酶标仪）或形态学检查。
(4)确定技术路线和研究方案
(5)阳性对照：建议选择香菇多糖作为阳性对照
六、学生自选实验
要求：每位学生展开想象的翅膀，大胆设想，广泛收集资料，周密设计方案，独立开展研究。部分优秀的研究论文可进一步深化、充实，作为毕业论文参加答辩。查阅文献，
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确定研究题目，根据实验室现有的设备等条件详细写出实验方案，列出需要的所有仪器名称、所有药品名称和数量（以便审核是否能够在现有的条件下开展实验）。
已有设备：普通光学显微镜、暗视野显微镜、普通离心机、低温高速离心机、石蜡切片机、可见紫外分光光度计、无菌操作台、电泳设备、酶标仪等。
选题范围：
细胞形态与结构观察、细胞化学、细胞膜生理、细胞增值、染色体分析、免疫功能等相关细胞生物学范畴的内容。研究内容尽量不要超出细胞生物学实验指导范畴，实验设计不必过于繁而在于巧，新颖和有创意。
设计实验：
查阅文献后，以小组为单位讨论，制定出详细的实验方案，包括实验目的、基本原理、所有的实验材料与用量、实验药品与用量、仪器设备、器具与数量、实验方法与步骤（实验测试手段要建立在自已的认知水平上），交教师审阅、修改、完善(实验方案要在实验前2-3周交给老师审阅)。
相关实验技术：常规制片技术、离心技术、比色法、组织切片（石蜡切片）、染色技术、电泳技术、染色体制备、细胞培养、细胞免疫学等。
考核将由4部分构成：（1）实验方案30%，要求创新性；（2）实验论文50%；（3）心得交流10%；（4）遵守制度、出勤率、实验态度等情况10%。
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