新型常压室温等离子体-紫外复合诱变选育埃莎霉素Ⅰ高产菌株

１８２　中国抗生素杂志２０１　８年２月第４３卷第２期　文章编号：１００１—８６８９（２０１８）０２—０１８２—０７　新型常压室温等离子体．紫外复合诱变选育埃莎霉素Ｉ高产菌株　戴剑漉张晓婷卢智黎王以光赫卫清　（中国医学科学院医药生物技术研究所国家卫计委抗生素生物Ｘ－程重点实验室，北京１０００５０）　摘要：目的　通过对埃莎霉素Ｉ产生菌ＷＳＪ．ＩＡ进行诱变选育研究，以期获得埃莎霉素Ｉ高产菌株。方法　使用多功能等　离子体诱变系统（ｍｕｌｔｉｉｆｍｃｔｉｏｎａｌ　ｐｌａｓｍａ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ，ＭＰＭＳ）对出发菌株的孢子进行等离子体和紫外复合诱变，设定不同　的诱变时间处理孢子悬液，通过致死率确定合适的诱变条件，利用突变株摇瓶发酵效价筛选出正突变菌株。结果　在ＭＰＭＳ射　频功率为ＩＯＯＷ，处理距离５ｒａｍ，气体流量１２．５ＳＬＭ，等离子体．紫外辐射时间为５０ｓ时，菌株致死率为９６．０８％。在此诱变条件　下，以突变株的初筛效价为指标的突变率、正突变率分别达到６３．９６％和２２．５２％，复筛效价是出发菌株１．５倍以上的有５株，占复　筛菌株的９％。最终筛选出一株发酵单位比出发菌株提高２２１％、埃莎霉素Ｉ组分含量提高１９２％的正突变株ＩＡ．４２５。４２Ｌ自动发　酵罐发酵结果表明，该菌株埃莎霉素Ｉ产量达到（２０００士２００）　ｇ／ｍＬ左右。结论　新型等离子体复合紫外诱变方式，可有效提高　菌株的埃莎霉素Ｉ发酵产量和组分含量。这为埃莎霉素Ｉ的大规模发酵和临床前研究奠定了良好基础。　关键词：埃莎霉素Ｉ；多功能等离子体诱变系统；复合诱变；选育　中图分类号：Ｒ９７８．１　文献标志码：Ａ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｉｓｏｍｙｃｉｎ·－Ｉ－－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎ　ｂｙ　ＭＰＭＳ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ｐｌａｓｍａ　ａｎｄ　ＵＶ　Ｄａｉ　Ｊｉａｎ—ｌｕ，Ｚｈａｎｇ　Ｘｉａｏ－ｉｒｎｇ，Ｌｕ　Ｚｈｉ—ｌｉ，Ｗａｎｇ　Ｙｉ—ｇｕａｎｇ　ａｎｄ　Ｈｅ　Ｗｅｉ—ｑｉｎｇ　（Ｋｅｙ　Ｌａｂ　ｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｆａｍｉｌｙ　Ｐｌａｎｎｉｎｇ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ，　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１　０００５０）　Ａｂｓｔｒａｅｔ　０ｂｊｅｅｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈ—ｙｉｅｌｄ　ｉｓｏｍｙｃｉｎ—Ｉ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎ　ｂｙ　ｍｅａｎｓ　ｏｆ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ＷＳＪ．ＩＡ　ｓｔｒａｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｓｐｏｒｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｓｔｒａｉｎ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｌａｓｍａ　ａｎｄ　ＵＶ　ｉｎ　ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｐｌａｓｍａ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ（ＭＰＭＳ１．Ｗｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｔｈｅ　ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｆｏｒ　ｐｌａｓｍａ　ｉ　ｅｔ　ａｎｄ　ＵＶ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｂｙ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　１ｅｔｈａｌｉｔｙ　ｒａｔｅｓ．Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｏｕｔ　ｂｙ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｉｔｅｒｓ　ｉｎ　ｓｈａｋｅ　ｆｌａｓｋ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．ＲｅｓｕｌｔｓⅥ　ｅｎ　ｔｈｅ　ｒａｄｉｏ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｐｏｗｅｒ　Ｏｆ　ＭＰＭＳ　ｗａｓ　１　００　Ｗ．ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｈａｎｄｌｉｎｇ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　５ｍｍ，ｔｈｅ　ｗｏｒｋｉｎｇ　ｌｆｏｗ　Ｏｆ　ｌ２．５ＳＬＭ，ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｐｌａｓｍａ—ＵＶ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　５０ｓ。ｔｈｅ　ｌｅｔｈａｌｉｔｙ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｒｅａｃｈｅｄ　９６．０８％．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅｓｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｏｕｔｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　６３．９６％ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　２２．５２％ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｉｔｅｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｎｔｓ　ａｎｄ　ＷＳＪ—ＩＡ　ｓｔｒａｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｆｉｖｅ　ｈｉｇｈ—　ｙｉｅｌｄ　ｉｓｏｍｙｃｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｓｈａｋｅ　ｌｆａｓｋ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｙｉｅｌｄｓ　ｏｆ　ｉｓｏｍｙｃｉｎ　１　ｗｅｒｅ　１．５　ｔｉｍｅｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ＷＳＪ—ＩＡ　ｓｔｒａｉｎ．ａｂｏｕｔ　９％ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｒｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｍｕｔａｎｔｓ．Ａｆｔｅｒ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｒｏｕｎｄｓ　ｏｆ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．　ｕｌｔｉｍａｔｅｌｙ，ＩＡ一４２５　ｓｔｒａｉｎ　ｄｉｓｐｌａｙｅｄ　ｔｈｅ　ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ　ｆｅａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｙｉｅｌｄ．Ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｉｔｅｒ　ａｎｄ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｓｏｍｙｃｉｎ　Ｉ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｉｎ　ＩＡ　４２５　ｗｅｒｅ　２２１％ａｎｄ　１９２％ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ＷＳＪ—ＩＡ　ｓｔｒａｉｎ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｔｉｔｅｒ　ｏｆ　ＩＡ一　收稿日期：２０１７．０４—１１　基金项目：国家自然科学基金（Ｎｏ．８１１７２９７２）、国家科技重大专项（Ｎｏ．２０１４ＺＸ０９２０１００３·００２）　作者简介：戴剑漉，男，生￣１９７５年，硕士，副主任技师，研究方向为微生物与生化药学，Ｅ—ｍａｉｌ：ｄａｉｊｉａｎｌｕ６５１１＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ　通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｅｗｅｉｑｉｎｇ＠ｉｍｂ．ｐｕｍｃ．ｅｄｕ．ｃｎ　新型常压室温等离子体．紫外复合诱变选育埃莎霉素Ｉ高产菌株戴剑漉等　４２５　ｉｎ　ｔｈｅ　４２Ｌ　ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ　ｗａｓ（２０００＋２００）ｇｇ／ｍＬ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｐｌａｓｍａ　ａｎｄ　ＵＶ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ａｎｄ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｓｏｍｙｃｉｎ　１　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ＷＳＪ—ＩＡ　ｓｔｒａｉｎ．ＩＡ一４２５　ｓｔｒａｉｎ　ｐａｖｅｄ　ｔｈｅ　ｒｏａｄ　ｆｏｒ　ｉｓｏｍｙｃｉｎ　Ｉ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　ｌａｒｇｅ　ｓｃａｌｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｔｒｉａｌｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｉｓｏｍｙｃｉｎ　Ｉ；ＭＰＭＳ；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ；Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　必特螺旋霉素（ｂｉｔｅｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ，ＢＴ），原名生技霉　素，药品注册名可利霉素是利用基因工程技术将耐　热链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）的４”．异戊酰　基转移酶基因（４”一ｉｓｏｖａｌｅｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｇｅｎｅ，ｉｓｔ）在螺　旋霉素宿主菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）ｒ￣异源表　变方法，等离子体中的活性粒子ｆ如处于激发态的氦　原子、氧原子、氮原子和ＯＨ自由基等）作用于微生　物能够改变其细胞壁或者细胞膜的结构及通透性并　引起基因损伤，进而导致微生物基因序列及其代谢网　络发生显著变化［８．　１。常压室温等离子体诱变具有射　达，所获得的基因工程菌的发酵产物［１】。ＢＴ是多组　分药物，主组分是异戊酰螺旋霉素（简称埃莎霉素，　ｉｓｏｍｙｃｉｎ）Ｉ、ＩＩ和ＩＩＩ，对革兰阳性菌有较强的活　性，尤其对肺炎链球菌、肺炎支原体、衣原体活性　强。它有较高的亲脂性，口服吸收快，组织渗透性　强，分布广，体内维持时间长，有较好的抗生素后　效应［２＿　１。埃莎霉素Ｉ的抗菌活性与ＢＴ多组分的混合　物没有显著差异，因此埃莎霉素Ｉ可以单独成药，　这样可以降低药物质控成本，而且可以做成注射剂　型。注射剂药效迅速，适用于危重患者或不宜口服　的患者且在质量控制方面要求高，发酵产生的多组　分抗生素很难达到注射剂的质控标准。ＢＴ是一个大　环内酯类抗生素，其主核是一个由ｉ６元环组成的内　酯环，与普拉特内酯同质，其内酯环的３位为羟基，　即螺旋霉素Ｉ组分、羟基乙酰化形成螺旋霉素ＩＩ组　分、丙酰化形成螺旋霉素ＩＩＩ组分。３位羟基的酰基　酯化是由３．Ｏ一酰基转移酶（３．Ｏ—ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）进行催　化，此酶对底物的选择具有一定的宽容性，对乙酰　基和丙酰基底物都能识别。我们在ＢＴ产生菌ＷＳＪ．１　中阻断３—０　酰基转移酶基因（ｓｓｐＡ）后获得了只产生埃　莎霉素Ｉ组分的菌种ＷＳＪ一２［５］，但其产量很低，只有　２００ｔｘｇ／ｍＬ左右；因此又将一个异源正调控基￣］ａｃｙＢ２　导入到ＷＳＪ．２中获得基因工程菌ＷＳＪ—ＩＡ［６］，产量达到　６００～８００ｌａｇ／ｍＬ，但这个产量还不能满足后续开发的　需要，因此有必要对菌株ＷＳＪ—ＩＡ进行进一步优化，　获得埃莎霉素Ｉ高产菌株。　紫外和化学诱变等传统诱变育种方法是获得高　产突变株、提高和保持生产水平的基本措施之一，　多年来一直应用于微生物的菌种改良。但是，长　期、重复使用某种诱变源，往往导致突变率低、突　变谱窄和抗性饱和【７１。因此，寻找新的诱变因子和　简单有效的诱变方法成为菌种诱变研究的热点。常　压室温等离子体（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ　ａｎｄ　ｒｏｏｍ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｐｌａｓｍａ，ＡＲＴＰ）诱变技术是近年来发展的一种新的诱　流温度低（２５～３５℃）、产生的活性粒子分布均匀、无　需真空装置、操作简易、安全性高、与生物大分子和　细胞作用明显等优点，现己成为快速突变各类微生物　基因组的有效方法。例如，该方法应用于阿维链霉菌　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）的选育中，诱变后其正突变率　达到２１％，获得了阿维菌素产量提高１８％并且阿维菌　素Ｂｌａ的产量特异性增长４０％的高产菌株【９】；对铜绿假　单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）进行诱变，诱变株　鼠李糖脂产量提高７４．１％ｆｌ０】；对钝顶螺旋藻（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）进行诱变，诱变株的生长速率提高３８％、多　糖含量提高１．８倍以上【ｕ］。综上所述，常压室温等离　子体作为一种新兴的高效生物突变手段，在菌种改　良领域将具有良好的应用前景。　目前，常压室温等离子体技术用于埃莎霉素Ｉ　产生菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ　ＷＳＪ—ＩＡ）的诱变育　种工作未见报道。本文采用的是一种新型多功能等　离子体诱变系统（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｐｌａｓｍａ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ，ＭＰＭＳ），ＭＰＭＳ是以氮气为工作气体，取代　了ＡＲＴＰ所使用的高成本氦气，同时复合紫外照射，　以期获得埃莎霉素Ｉ高产突变株，为该抗生素投入　到大规模发酵提供优良菌株。　１材料与方法　１．１材料　１．１．１菌株　埃莎霉素Ｉ产生菌ＷＳＪ—ＩＡ（Ｓ．ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ　ＷＳＪ－ＩＡ）由本实验室保藏。　１．１．２培养基　（１）斜面和平板培养基（ｇ／Ｌ）：黄豆饼粉２Ｏ．０，葡　萄糖１０．０，淀粉３０．０，碳酸钙５．０，氯化钠４．０，琼脂　１８．０，ｐＨ值自然。　（２）种子培养基（ｇ／Ｌ）：黄豆饼粉１５．０，蛋白胨　ｆＦ４０３）３．０，淀粉３０．０，磷酸二氢钾０．５，碳酸钙５．０，　氯化钠４．０，ｐＨ值自然。　（３）发酵培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖５．０，淀粉６０．０，碳　酸钙５．０，氯化钠１０．０，硫酸镁１．０，硝酸铵６．０，磷酸　二氢钾０．５，鱼粉２０．０，酵母粉５．０，ｐＨ值自然。　（４）生物检定培养基（ｇ／Ｌ）：牛肉膏３．０，酵母膏　３．０，蛋白胨（Ｆ４０３）１０．０，葡萄糖１．０，氯化钠５．０，琼　脂１２．０，ｐＨ８．０。　１．１．３仪器与试剂　Ｍ　ＡＮ　Ｄ　Ｅ　Ｌ　Ａ型多功能等离子体诱变系统　（ＭＰＭＳ），北京艾德豪克国际技术有限公司；Ａｇｉｌｅｎｔ　１　２００高效液相色谱仪；高压灭菌器（Ｈｉｒａｙａｍａ１；　ＺＨＷＹ－３２１２型台式振荡器，上海智城有限公司；　ＨＰＬＣ所用试剂为色谱纯，其余试剂均为分析纯。　１．２方法　１．２．１等离子体．紫外复合诱变　（１）单孢子悬液的制备：用无菌水将斜面上的埃　莎霉素Ｉ产生菌ＷＳＪ—ＩＡ孢子洗下，置于装有玻璃珠　的灭菌三角瓶中，振荡（２５℃，２１０ｒ／ｍｉｎ）３０ｍｉｎ，使孢　子分散。用己灭菌的装有脱脂棉的滤器过滤除去菌　丝，制成浓度约为１０５个／ｍＬ单孢子悬液，备用。　（２）等离子体诱变：在超净工作台中用移液枪　移取２０￣ｔＬ孢子悬液，均匀涂抹在无菌不锈钢载片　上，将其置于无菌平皿内移至提前开机预热３０ｍｉｎ　的ＭＰＭＳ生物诱变育种机中，射频功率为１００Ｗ，处　理距离５ｍｍ，处理温度为室温，气体流量１２．０５ＳＬＭ　（ｓｔａｎｄａｒｄ　ｌｉｔｅｒｓ　ｐｅｒ　ｍｉｎｕｔｅ），以９９．９９％及以上氮气为　工作气体，以处理时间为诱变的主要操作参数，从　３０ｓ依次递增￣Ｏ６０ｓ，垂直照射。处理过后，用ｌｍＬ无　菌水彻底洗下孢子，置于无菌试管中。处理液用无　菌水稀释后均匀涂布于平板培养基上，２８℃避光培　养１０ｄ，通过菌落计数法（ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ，ＣＦＵ）　计算菌株的致死率。　（３１等离子体．紫外复合诱变：按照“１．２．１”项下　等离子体诱变方法，取制备好的２０￣ｔＬ孢子悬液，放　入诱变系统中，打开紫外灯并注入氮气同时进行诱　变，紫外诱变条件：照射距离３０ｃｍ，波长２５４ｎｍ，　功率３０Ｗ，斜４５℃照射。以处理时间为诱变的主要　操作参数，从４５ｓ依次递增到５５ｓ。处理过后，用ｌｍＬ　无菌水将孢子洗下，置于无菌试管中。处理液用无　菌水稀释后均匀涂布于平板培养基上，２８℃避光培　养１０ｄ，通过菌落计数法（ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ，ＣＦＵ）　计算菌株的致死率。　１．２．２诱变致死率及突变率的计算　诱变菌株致死率　）＝（未诱变平板菌落数．诱变后　平板菌落数、／未诱变平板菌落数×１００％。　中国抗生素杂志２０１８年２月第４３卷第２期　诱变株的突变率的计算以发酵效价为标准。发酵　效价提高或降低２０％以上的诱变株定义为突变株，发　酵效价提高的突变株定义为正突变株。因此，正突变　率（％）＝正突变株数／总诱变菌株数×１００％，负突变率　（％）＝负突变株数／总诱变菌株数×１００％，突变率（％＇）＝　突变株数／总诱变菌株数×１０ｏ％。　１．２．３菌株筛选、发酵及发酵液的提取　摇瓶初筛：挑取经处理的单菌落于斜面培养基　上，２８℃培养１０～１２ｄ，菌株长好后挖块接种到装量　３０ｍＬ发酵培养基的１００ｍＬ三角瓶，２１０ｒ／ｍｉｎ、２８℃　培养９６～１２０ｈ后，发酵液经离心取上清液稀释，进行　埃莎霉素Ｉ生物活性检测。　摇瓶复筛：挑选一定量的初筛正突变株，经传代　后接种于种子培养基，２１０ｒ／ｍｉｎ、２８。Ｃ培养４８～５６ｈ，　以８％的接种量转接于发酵培养基（５００ｍＬ￣角瓶，装　５０ｍＬ发酵培养基　，２　１　Ｏｒ／ｍｉｎ、２８℃培养９６ｈ进行二　级摇瓶发酵复筛。　自然分离：将得到的突变株单孢子悬液稀释，　取０．１ｍＬ涂布于分离平板上，２８℃培养１０～１２ｄ，挑取　单菌落于斜面培养基上，２８℃培养１０～１２ｄ，摇瓶发　酵筛选。　发酵液的提取：发酵液室温３０００ｒ／ｍｉｎ离心　１５ｍｉｎ，上清液用１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ调至ｐＨ８．５后，用１／２　体积乙酸乙酯萃取，取出酯相于平皿中吹干，用适　量乙腈溶解。　ｌＩ２．４发酵罐验证　将培养成熟的斜面，挖块接种于种子培养基　中，２８℃，２１０ｒ／ｍｉｎ，培养６０～６５ｈ，按１２％～１３％接　种量接种于二级种子培养基中，培养２４～２６ｈ后，　按８％接种量接种于４２Ｌ发酵罐中，２８℃，起步转速　２００ｒ／ｍｉｎ，根据溶氧（ＤＯ）变化逐步调至４８０ｒ／ｍｉｎ，通　气量１：Ｉ（ＶＶＭ），培养９６ｈ左右放罐，测定发酵单位。　１．２．５抗生素生物效价测定　以枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＣＰＣＣ　ｌ　０００２９）　为检定菌，参考《中华人民共和国国药典》２００５年　版（二部）乙酰螺旋霉素微生物检定法【ｌ２】。采用杯碟　法，用标准曲线法进行测定。参照文献［１３］进行诱变　菌株摇瓶发酵产量分布的参数分析，分别计算产势　Ａ、变势Ｂ及菌株发酵产量的稳度（ｃ　和偏度（　）。　１．２．６　ＨＰＬＣ检测　发酵液经提取、挥干后溶于色谱纯乙腈，用　０．２　ｍ滤膜过滤，取３～５　Ｌ进行ＨＰＬＣ检测。色谱　议：Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００高效液相色谱议，二级管阵列检测　新型常压室温等离子体．紫外复合诱变选育埃莎霉素Ｉ高产菌株戴剑漉等　器，色谱柱：ＹＭＣ　Ｃ　（４．６ｍｍ￣２５０ｍｍ，５ｇｍ），流动　相：乙腈：乙酸胺（６０：４０，Ｆ／　，检测波长：２３ｌｎｍ，　流速：ｌｍＬ／ｍｉｎ，柱温：２５℃。以埃莎霉素Ｉ标准　品为对照品，检测并计算埃莎霉素Ｉ（保留时间为　２４．９８２ｍｉｎ）的百分含量，以此确定埃莎霉素Ｉ的相对　含量。　２结果　２．１等离子体一紫外复合诱变　２．１．１等离子体诱变剂量的确定　按照“１．２．１”项下等离子体诱变方法对经ＭＰＭＳ　诱变后的埃莎霉素Ｉ产生菌致死率曲线进行绘制，　结果如图１，结果显示：埃莎霉素Ｉ产生菌的致死率　与等离子照射的时间有着很大关联，随着处理时间　的延长致死率明显升高。处理时间为３０ｓ时，致死率　为６．８５％；当处理时间达￣ｌＪ４５ｓ，致死率为９２．３３％；　当处理时间达￣ｌＪ６Ｏｓ，致死率为１００％。根据致死率曲　，ａ　＿Ｉ　一　鲁。　线，考虑复合诱变后获得足够的菌株数量，本实验复　合诱变采用的ＭＰＭＳ处理时间选取４５～５５ｓ。　２．１．２等离子体．紫外复合诱变的致死率　按照“１．２．１”项下等离子体．紫外复合诱变方　法，将出发菌株埃莎霉素Ｉ产生菌单孢子悬液放　入诱变系统中，打开紫外灯并注入氮气同时进行诱　变，等离子体诱变处理４５、５０￣Ｄ５５ｓ；因突变本身具　有随机性，其致死率和正突变之间的关系因不同的　诱变方法和菌株特性不同而不尽相同。本实验为便　于获得单菌落，选取紫外照射时间相应同为４５、５０　和５５ｓ。复合诱变处理的菌液涂布于分离平板培养基　上，２８℃，培养１０ｄ，挑取菌落，计算致死率。结果　显示ＭＰＭＳ—ＵＶ　４５、５０和５５ｓ　３种条件致死率分别为　９２．９１％、９６．０８％和ｌ００％ｆ图２）。本实验选取ＭＰＭＳ．　３Ｏ　３５　４０　４５　５０　５５　６０　Ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｔｉｍｅ／ｓ　图１埃莎霉素Ｉ产生菌ＷＳＪ．ＩＡＭＰＭＳ诱变致死率曲线　Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｌｅｔｈａｌｉｔｙ　ｒａｔｅ　ｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ　ＷＳＪ－ＩＡ　ｔｒｅａｔｅｄｂｙＭＰＭＳ　１０Ｏ　８０　６０　４０　２０　Ｏ　ＭＰＭＳ．ＵＶ　４５　ＭＰＭＳ—ＵＶ　５０　ＭＰＭＳ－ＵＶ　５５　Ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｔｉｍｅ／ｓ　图２埃莎霉素Ｉ产生菌ＷＳＪ．ＩＡ　ＭＰＭＳ－ＵＶ诱变致死率　Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｌｅｔｈａｌｉｔｙ　ｒａｔｅ　ｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ　ＷＳＪ－ＩＡ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ＭＰＭＳ－ＵＶ　ＵＶ　５０ｓ作为复合诱变处理条件。　２．２突变菌株发酵产量分布的变势参数分析　出发菌株ＷＳＪ．ＩＡ经过ＭＰＭＳ．ＵＶ诱变处理５０ｓ，　将诱变后的孢子悬液稀释涂布后，所挑取的突变菌　株按照“１．２．３”项下方法进行摇瓶初筛发酵，突变　菌株发酵单位与出发菌株比较，结果显示：经过复　合诱变获得的变异菌株的突变率为６３．９６％，其中正　突变率为２２．５２％。选取５６株初筛高产菌株进行第一　轮复筛，其与出发菌株ＷＳＪ—ＩＡ效价的比值如图３所　示。５６株复筛菌株的效价高于出发菌株ＷＳＪ．ＩＡ的突　变株占５２％，其中发酵效价是出发菌株１．５倍以上的　有５株，占复筛菌株的９％。　在发酵变势参数分析（表１）中，可见复筛菌株的　相对效价平均值为１０２（％），平均产量的标准差　为　４４．６７，稳度　达２．２８，偏度　为１．６５，出现了明显的　正偏，使变势　达到１３１．６０。表明ＭＰＭＳ．ＵＶ处理改　４０　３Ｏ　２０　１０　０－０．５　０．５一１．０　１．０－１．５　１．５￣２．０　２．０－３．０　３．０－３．５　Ｒａｔｉｏ　ｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｉｔｅｒ　ｏｆｈｉｇｈ　ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ　ｏｖｅｒ　ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｓｔｒａｉｎ　图３突变菌株产量分布图　Ｆｉｇ．３　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｉｔｅｒ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｈｔｅ　ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｓｔｒａｉｎ　中国抗生素杂志２０１８年２月第４３卷第２期　表１突变菌株产量分布参数分析　Ｔａｂ．１　Ｔｈｅ　ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆｍｕｔａｎｔｓ　按“１．２．６”项下方法对高产菌株ＩＡ一４２５３１］出发菌　株ＷＳＪ—ＩＡ发酵产物进行ＨＰＬＣ分析，比较二者产生埃　莎霉素Ｉ组分的比例。ＨＰＬＣ检测发现，埃莎霉素Ｉ　的保留时间是在２４ｍｉｎ左右。从图５中可以看出，在　上样量相同条件下，ＩＡ一４２５菌株中埃莎霉素Ｉ特征峰　的峰高和峰面积都大于ＷＳＪ．ＩＡ的峰值。从表２的统计　中，在ＩＡ．４２５菌株中埃莎霉素Ｉ占总发酵产物比例为　３６－３７％士３．３９％左右，而ＷＳＪ—ＩＡ中埃莎霉素Ｉ所占比　注：ｘ：平均产量；＆平均产量的标准差；Ｃｔ：产量分布的稳度回　例为１２．６７％－４－２．７０％，高产菌株ＩＡ一４２５埃莎霉素Ｉ的　组分比例是出发菌株ＷＳＪ—ＩＡ的２．９２倍左右。　ｓ）；Ｃｓ：产量分布的偏￣Ｚ（Ｘｉ－ＴＯ　／ｎ／Ｓ　；￣Ｂ＝（６／Ｃｔ）　（１＋ｃ　８）　变了出发菌株ＷＳＪ—ＩＡ基因群的产量限定性，对菌株　ＷＳＪ．ＩＡ有良好的诱变效果。　２．３高产菌株发酵产物的检测　根据第一轮复筛结果，筛选到５株产量提高５０％　以上的高产菌株，其中１株产量提高２００％以上。为　了准确的获得遗传稳定的高产突变株，经反复筛　选及传代，最终筛选到了１株突变菌株，命名为ＩＡ．　３　３　２　２　ｏ　ＢＩ　．Ｉ　１　１　４２５。其埃莎霉素Ｉ相对产量达￣１Ｊ３２１％，比出发菌　如∞　如∞如　∞　∞　０　ＷＳＪ．ＩＡ　ｓｔｒａｉｎｓ　株ＷＳＪ—ＩＡ提高了２２１％。ＩＡ一４２５菌株经５次传代后，　按照“１．２．４”项下方法进行发酵罐验证试验，证明　其遗传性能比较稳定，生物合成埃莎霉素Ｉ的产量　达到（２ｏ０Ｏ士２００）　ｇ／ｍＬ左右（图４）。　ＩＡ一４２５　图４出发菌株ＷＳＪ．ＩＡ和突变菌株ＩＡ．４２５的相对效价　Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｔｉｔｅｒ　ｏｆ　ｉｓｏｍｙｃｉｎ　Ｉ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ＷＳＪ—　ＩＡ　ｓｔｒａｉｎ　ａｎｄ　ｈｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｔＩＡ．４２５　ｌ０　２０　３Ｏ　４０　ｔ／ｍｌｎ　５Ｏ　６Ｏ　Ｉｓｏｍｖｃｉｎ　Ｉ　Ｂ　　．．　√　１０　２０　３０　４０　５Ｏ　６０　ｔ／ｍｉｎ　Ａ：Ｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ　Ｉ：Ｂ：Ｉｓｏｍｙｃｉｎ　Ｉ：Ｃ：ＷＳＪ—ＩＡ；Ｄ：ＩＡ·４２５　图５　ＷＳＪ．ＩＡ和ＩＡ　４２５发酵产物的ＨＰＬＣ检测　Ｆｉｇ．５　ＨＰＬＣ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｆｒｏｍ　ｓｔｒａｉｎ　ＷＳＪ－ＩＡ　ａｎｄ　ＩＡ一４２５　新型常压室温等离子体．紫外复合诱变选育埃莎霉素Ｉ高产菌株戴剑漉等　表２　ＷＳＪ．ＩＡ和ＩＡ．４２５发酵产物中埃莎霉素Ｉ的组分含量　Ｔａｂ．２　Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｉｓｏｍｙｃｉｎ　Ｉ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＷＳＪ．ＩＡ　ａｎｄ　ＩＡ－４２５　ｓｔｒａｉｎｓ　２．４高产菌株ＩＡ一４２５产量分布参数评价　优良的生产菌株应具有高产、稳产、不易蜕变　的特征，用产势Ａ＝ｘ（Ｃｔ／６）“　（１＋　／８）“ｚ的数值来评价　生产菌株，产势Ａ愈大，菌株愈优［Ｉ３　Ｊ。由表３参数分　析表明ＩＡ一４２５高产菌株自然分离菌株的平均产量明　显提高，稳度　显著上升，表明突变株产量基因群　的遗传稳定性强于出发菌株。突变株正偏也高于出　发菌株，使出发菌株的产势Ａ由８４．５２提高到２９Ｏ．１４，　显著提高了２４３％。因此，可以认为菌株ＩＡ．４２５明显　优于出发菌株ＷＳＪ—ＩＡ。　表３高产菌株ＩＡ．４２５产势参数分析　ａＴｂ．３　Ｔｈｅ　ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　ＩＡ一　４２５　ｈｉ曲－ｙｉｅｌｄ　ｓｔｒａｉｎ　注：　：菌株数；产势Ａ＝ｘ（Ｃｔ／６）　０＋Ｃｓ／８）吨　３讨论　本研究首次采用新型常压室温等离子体一紫外复　合诱变选育埃莎霉素Ｉ高产菌株，结果表明ＭＰＭＳ　诱变方式诱变效果显著，能快速有效地提高埃莎霉　素Ｉ产生菌的生物合成能力。最终获得１株发酵单位　较出发菌株提高２２１％，并且组分含量提高１９２％的埃　莎霉素Ｉ高产菌株ＩＡ一４２５，经发酵罐放大实验埃莎　霉素Ｉ产量达到２０００　ｇ／ｍＬ左右。为该抗生素的大规　模发酵放大奠定了良好基础。证明了ＭＰＭＳ在微生　物育种中切实可行，为诱变选育改善菌株生产能力　提供了新的技术手段。　研究表明，等离子体能够以一种独特的机制破　坏单核苷酸的磷酸二酯键，依据核苷酸序列的不同　将寡核苷酸降解成不同的小片段【　】，并诱发生物细　胞启动ＳＯＳ修复机制。ＳＯＳ修复为一种高容错率等　离子体中的活性粒子对菌株细胞的遗传物质造成损　伤，并诱发生物细胞启动ＳＯＳ修复机制的过程。在　修复过程中会产生种类丰富的错配位点，并稳定遗　传进而形成突变株【·ｓ】。紫外线是一种非电离辐射，　对原核生物而言是一种比较好的诱变因素，在紫外　波长为２５４ｎｍ（核酸的吸收高峰）的诱变条件下，紫外　辐射可引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，导　致生物有可能发生基因突变，但微生物本身具有自　我修复机制，能修复一些突变碱基。而等离子体诱　变通过其活性粒子作用于微生物细胞，改变其ＤＮＡ　损伤修复机制，突破了紫外单独诱变的局限。采用　常压室温等离子体同时结合紫外照射，相对于单一　因子诱变亦可提供更丰富的突变位点，有效避免了　使用单一诱变剂产生的诱变饱和效应［１６］。本实验对　这种新的诱变方法进行了探索，成功筛选出埃莎霉　素Ｉ高产的正突变株，再次证实ＭＰＭＳ在微生物菌　种选育中的有效性。然而，目前关于等离子体产生　的多种活性粒子对生物大分子和整细胞的作用机制　及其突变机理的认识还十分有限，ＭＰＭＳ诱变在微　生物育种方面的研究及应用还很少，也很不系统，　基于ＭＰＭＳ致微生物突变机制的复杂性，以及生物　内部相互作用的复杂性和不确定性，ＭＰＭＳ技术所　获得的诱变效应还需进一步研究。安莉颖等【　，】通过　等离子体诱变里氏木霉（ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）ＲｕｔＣ３０　筛选获得了乳清酸核苷．５’．磷酸脱羧￣ｐｙｒ４基因缺陷　菌株ＲｕｔＣ３０ＡＵ３，根据突变株ＡＵ３　ｐｙｒ４基因测序结　果发现，基因在多个位点发生突变，导致乳清酸核　苷．５’．磷酸脱羧酶失活，当转￣．ｔＳｐｙｒ４基因后可回复　野生性状且传代稳定，但在诱变过程中并不能排除　存在其他基因的突变。ＭＰＭＳ引起的变异可能是非　定向的，不像其他基因标签法诱导变异更易于定位　或克隆变异的基因位点，可能是其重要的限制【　］。　正确使用和努力掌握ＭＰＭＳ育种的规律，有可能帮　助我们早日彻底改变微生物育种研究工作“艰难爬　坡”的徘徊局面，培育出突破性的优良菌种，直接　服务于生产。因此，利用系统生物学方法分析研究　等离子体诱变育种及对各类生物分子的作用机理十　分必要［　】。通过系统生物技术将获得的相关组学数　据整合及计算机建模和预测，从而确定相关的遗传　操作靶点，使微生物的遗传育种更具定向性。Ｗｉｎｔｅｒ　等［２０】对等离子体处理前后Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ的蛋白质组　１８８　中国抗生素杂志２０１　８年２月第４３卷第２期　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｇｌｏｗ　ｄｉｓｃｈａｒｇｅ　ｐｌａｓｍａ［Ｊ］．ＪＡｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１０，　１０８（３）：８５１－８５８．　和转录组分析，发现了多种基因和蛋白质的变化。　Ｌｉ等【　】利用等离子体处理脂肪酶的研究发现，经过　０１陈利娟，吴斌，何冰芳．ＡＲＴＰ诱变选育鼠李糖高产菌及鼠　ｆ１等离子体处理，脂肪酶的活性升高。圆二色光谱分　析结果表明，等离子体处理后脂肪酶的结构发生了　明显变化，分析推断等离子体中的化学活性物质是　造成酶结构变化、酶活升高的主要原因。因此加强　ＭＰＭＳ诱变机制的研究才能使其在微生物育种中发　挥更大的作用。　参考文献　【１】ＳｈａｎｇＧＤ，Ｄａｉ　ＪＬ，ＷａｎｇＹＧ．Ｃｏｎｓｆｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ａ　ｓｔａｂｌｅ　ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｓｈｅｎｇｊｉｍｙｅｉｎ［Ｊ］．Ｊ　Ａｎｔｉｂｉｏｔ（Ｔｏｋｙｏ），２００１，５４（１）：６６—７３．　ｆ２１　孙丽文，朱锦桃，林赴田．生技霉素药代动力学性能研究［Ｊ】．　中国药理学通报，２０００，ｌ　６（６）：６９４．６９８．　『３］　Ｓｈｉ　Ｘ　Ｇ，Ｚｈｏｎｇ　Ｄ　Ｆ，Ｓｕｎ　Ｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｂｉｔｅｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ　ｉｎ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ａｓｉａｎ　Ｊ　Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂｏｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ，２００３，３（２）：１３４—１３７．　『４１　Ｓｈｉ　Ｘ　Ｇ，Ｓｕｎ　Ｙ　Ｍ，Ｚｈａｎｇ　Ｙ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｔｉｓｓｕｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｔｅｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ　ａｎｄ　ｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ　ｉｎ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｓｉｎ，２００４，２５（１１）：１３９６－１４０１．　【５］Ｍａ　Ｃ　Ｙ，Ｚｈｏｕ　Ｈ　Ｘ，Ｌｉ　Ｊ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　４＂－ｉｓｏｖａｌｅｒｙｌｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ－－Ｉ··ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎ　ｂｙ　ｉｎ－·ｆｒａｍｅ　ｐａｒｔｉａｌ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　３－Ｏ－ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ　ＷＳＪ－１，ｔｈｅ　ｂｉｔｅｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｅｒ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１１，６２（Ｉ）：１６－２０．　ｆ６１　戴剑漉，卢智黎，林灵，等．利用异源正调控基因ａｃｙＢ２　构建埃莎霉素Ｉ高产菌株［Ｊ］．中国生物工程杂志，２０１７，　３７（３）：６５—７２．　ｆ７１　汪杏莉，李宗伟，陈林海，等．工业微生物物理诱变育种　技术的新进展［Ｊ］．生物技术通报，２００７，２３（２）：１１４—１１８．　『８１　Ｚｈａｎｇ　Ｘ，Ｚｈａｎｇ　Ｘ　Ｆ，Ｌｉ　Ｈ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ　ａｎｄ　ｒｏｏｍ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｐｌａｓｍａ（ＡＲＴＰ）ａｓ　ａ　ｎｅｗ　ｐｏｗｅｒｆｕｌ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４，９８（１２）：　５３８７—５３９６．　［９１　Ｗａｎｇ　Ｌ　Ｈｕａｎｇ　Ｚ　Ｌ，Ｌｉ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｎｏｖｅｌ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ　ｕｓｉｎｇ　ａｎ　ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ　李糖脂促进枯草芽孢杆菌产纤维素酶的研究［Ｊ］．生物技　术通报，２０１５，３１（１１）：１９５．２０１．　［１ｌ】Ｆａｎｇ　Ｍ　Ｙ＇Ｊｉｎ　Ｌ　Ｈ，Ｚｈａｎｇ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｒａｐｉｄ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ　ｂｙ　ａ　ｎｅｗ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ　ａｎｄ　ｒｏｏｍ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｐｌａｓｍａｓ（ＡＲＴＰ）ａｎｄ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｍｕｔａｎｔ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｗｉｔｈ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ［Ｊ］．　ＰｌｏＳ　Ｏｎｅ，２０１３，８（１０）：１－１２．　『１２１国家药典委员会．中华人民共和国药典ｉｓ］．（２００５年版二　部）．北京：化学工业出版社，２００５：附录ＸＩＡ．　［１３］刘垂王于．微生物菌株的参数分析［Ｊ］．微生物学报，１９８０，　２Ｏ（２）：１６６—１７２．　『１４１　Ｌｉ　Ｇ，Ｌｉ　Ｈ　Ｐ，Ｗａｎｇ　Ｌ　Ｙ，ｅｌ　ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｒａｄｉｏ—　ｒｆｅｑｕｅｎｃｙ，ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ－ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｇｌｏｗ　ｄｉｓｃｈａｒｇｅｓ　ｗｉｔｈ　ｈｅｌｉｕｍ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｐｈｙｓ　Ｌｅｔｔ，２００８，９２（２２）：２２　１　５０４．　『１５１　Ｏｄａ　Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｓ，Ｏｋｉ　Ｉ，ｅｔ　ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ｎｅｗ　ｓｙｓｔｅｍ　（ｕｍｕ—ｔｅｓｔ）ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｍｕｔａｇｅｎｓ　ａｎｄ　ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ［Ｊ］．Ｍｕｒａｔ　Ｒｅｓ，１９８５，１４７（５）：２１９—２２９．　『ｌ６】章丽，戴梦，郑桂珍，等．等离子体一紫外复合诱变选育四　羟基环孢菌素衍生物高产菌株［Ｊ］　微生物学杂志，２０１４，　３４（１）：６８—７１．　『１７］安莉颖，易欣欣，秦丽娜，等．里氏木霉ＲｕｔＣ３０常温常压等　离子体（ＡＲＴＰ）诱变筛选　基因缺陷型菌株及转化系统　的建立『Ｊ］．菌物学报，２０１４，３３（６）：１２７２—１２８０．　ｆ１８１李宏宇，鲁国东，王明海，等．稻瘟病菌微波诱发突变体的　分析［Ｊ］．菌物系统，２００３，２２（４）：６３９—６４４．　『ｌ９１张雪，张晓菲，王立言，等．常压室温等离子体诱变育种及　其应用研究进展［Ｊ］＿化工学报，２０１４，６５（７）：２６７６—２６８４．　『２０］Ｗｉｎｔｅｒ　Ｔ，Ｗｉｎｔｅｒ　Ｊ，Ｐｏｌａｋ　Ｍ，ｅｌ　ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｌｏｂａｌ　ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｇａｓ　ｐｌａｓｍａ　ｏｎ　ｖｅｇｅｔ￣ｌｖｅ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｎｉｓｍｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１１，１１（１７）：３５１８—３５３０．　『２１］ＬｉＨ　Ｐ，ＷａｎｇＬ　ＬｉＧ，ｅｔａ１．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｌｉｐａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｈｅｌｉｕｍ　ｒａｄｉｏ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ，ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ。ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｇｌｏｗ　ｄｉｓｃｈａｒｇｅ　ｐｌａｓｍａ　ｊｅｔ［Ｊ］．Ｐｌａｓｍａ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｐｏｌｙｍ，２０１　１，８（３）：　２２４．２２９．