1,3-丙二醇高产变异菌株的紫外诱变选育

山地农业　生物学报２７（２）：１３４～１３７，２００８　Ｊｏｕｍａｌ　ｏｆ　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１，３一丙二醇高产变异菌株的紫外诱变选育　庄　莹　，兰琳　（１．福建省泉州市农业学校，福建泉州３６２２４１；２．华侨大学生物工程系，福建泉州３６２０２１）　摘要：在高效液相色谱同时检测多种组分的基础上，建立了高效液相色谱法测定克雷伯杆茵ＫｌｅｂｓｉｅＵａｐｎｅｕｍｏ－　ｍｉａｅ发酵甘油产物１，３一丙二醇（１，３一ＰＤ）含量的方法；同时应用单因素考查法确定较优的筛选高产１，３一ＰＤ　生产茵株紫外诱变条件，并在逐步提高筛选平板培养基中甘油浓度（６ｏ～９０ｇ／，Ｌ）的情况下经多轮诱变筛选，获得　１株能够耐较高浓度甘油的高产１，３一ＰＤ的变异茵株。经考查，较优的紫外诱变条件为：紫外灯功率３０Ｗ，照射　距离３４ｃｍ，茵体浓度１０。个・ｍＬ～，稀释１０　倍后进行诱变筛选，较优照射时间为６ｍｉｎ；经６轮诱变筛选，筛选出　能够耐９ｏｇ／Ｌ甘油的高产１，３一ＰＤ的变异茵株ＫＶＩ一１，其１，３一ＰＤ的产量较原始茵株提高３０％左右；变异茵株　经６代遗传稳定性考察，甘油转化率均稳定在４５％左右，１，３一ＰＤ产量稳定在４０ｇ／，Ｌ左右，变异茵株ＫＶＩ一１可　作为生产工艺研究的出发茵株。　关键词：高效液相色谱；１，３一丙二醇；茵株；诱变；甘油　中图分类号：０６５７，７２；０６５７．７２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００８—０４５７（２ｏｏ８）０２—０１３４一ｏ４　１，３一ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ　ｈｉｇｈ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ｍｕｔａｎｔ　ＺＨＵＡＮＧ　Ｙｉｎｇ。，ＬＡＮ　Ｌｉｎ：（１．Ａｒｇｉｃｕｈｕｒｅ　Ｓｃｈｏｏｌ，Ｑｕａｎｚｈｏｕ，Ｑｕａｎｚｈｏｕ，Ｆ￣ｉａｎ　３６２２４１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｑｕａｎｚｈｏｕ，Ｆｕｉｆａｎ　３６２０２１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：１，３一ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ（１，３一ＰＤ）ｍｅｎｓｕｒａｔｅ　ｂｙ　ＨＰＬＣ　ＷａＳ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＨＰＬＣ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｏｆ　ＫｌｅｂｓｉｅＵａ　ｐｎｅｕｍｏｍｉａｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍ　ｇｌｙｃｅｒｏｌ（Ｇｌｙ）ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ｍｕｔａｎｔ　ｃｏｎｄｉｉｔｏｎ　Ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ．Ａｍｕｔａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｎｄｕｒｉｎｇ　ｈｉｇｈ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｇｌｙｃｅｒｏｌ　ａｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｈｉｇｈ　１．３一ＰＤ　Ｗａｓ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｍｕｌｔ—ｃｙｃｌｅ　ｍｕｔａｔｅ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｇｙｃｅｒｏｌ　ｉｎ　ｆｉｌｔｒａｔｄｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗａｓ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｆｒｏｍ　６０ｇ／，Ｌ　ｔｏ　９０　ｇ／Ｌ　Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｍｕｔａｔｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｌｕｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ｏｐｗｅｒ　Ｗａｓ　３０Ｗ，ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｓｐａｃｅ　Ｗａｓ　３４ｃｍ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｗａｓ　１０。／ｍＬ．ｄｉｌｕｔｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　１０～ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｕｉｔ　ｉｒｒａｄｉａｔｅ　ｔｉｍｅ　Ｗａｓ　６　ｍｉｎ．Ａ　ｍｕｔｎａｔ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＫＶＩ一１　ｔｈａｔ　ｅｎｄｕｒｉｎｇ　９０ｓ／Ｌ　ｌｇｙｃｅｒｏｌ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｐｒｏｄｕｃｅ　１，３一ＰＤ　Ｗａｓ　ａｃｑｕｉｅｒｄ　ａｆｔｅｒ６　ｃｙｃｌｅ　ｍｕｔａｔｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　１，３一ＰＤ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ａｂｏｕｔ　３０％ｔｈａｎ　ｏｒｉｇｉｎａｌｉｔｙ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｔｈｅ　ｉｎｈｅｒｉｔ　ｓｔｂａｉｌｉｙｔ　ｏｆｔｈｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｗａｓ　ｒｅｖｉｅｗｅｄ　ｆｏｒ　６．　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｌａｔｅ　ｒａｔｉｏ　ｓｔｂａｉｉｌｚｅｄ　ａｔ　４５％，１，３一ＰＤ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ　ａｔ　４０　ｇ／Ｌ，ｔｈｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＫＶＩ一１　ｅｏｕｌｄｂｅ　ａｐｐｌｉｄｅ　ｆｏｒ　１．３一ＰＤ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＨＰＬＣ；１，３一ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ；ｂａｃｔｅｒｉｍｕ；ｍｕｔｎａｔ；ｇｌｙｃｅｒｏｌ　１，３一丙二醇（１，３一ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ　１，３一ＰＤ）是一种重要的化工原料，其最主要的用途则是作为聚酯、聚　醚和聚亚氨酯的单体…。较之以乙二醇作单体合成的聚酯具有更优良的特性。以１，３一ＰＤ为原料生产　的聚酯极大地提高了产品性能，是当前国际上合成纤维开发的热点。传统的１，３一ＰＤ化学合成法所用的　催化剂体系复杂，制作工艺苛刻，对设备要求较高，回收率不高　】。因此，随着石油资源的贫乏与环境污　染问题的加重，以可再生资源为原料、污染程度低的生物技术法生产１，３一ＰＤ具有独特的优势　。　。李　琛等　从自然界筛选得到９株可发酵甘油生产１，３一ＰＤ的肠道细菌，经化学诱变，１，３一ＰＤ最终产量为　２％；利用微生物歧化甘油（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，Ｇｌｙ）生产１，３一ＰＤ的生物发酵过程中存在多种物质的抑制作用。为　了提高目标产物产量需要有较高浓度的底物，但底物甘油的初始浓度的过高则又会对菌株细胞产生毒性，　抑制细胞生长和１，３一ＰＤ的生成　Ｊ。因此为了实现１，３一ＰＤ工业化微生物生产，如何提高生产菌株对　收稿日期：２００７—１２—０６；修回日期：２００８—０１—１０　作者简介：庄莹（１９７１一），女，福建惠安人，讲师，主要从事农学类学科教学工作。　维普资讯 http://www.cqvip.com 第２期　庄莹。等：１，３一丙二醇高产变异菌株的紫外诱变选育　１３５　甘油耐受程度从而提高１，３一ＰＤ产量是关键。　以甘油为底物发酵生产１，３～ＰＤ的菌种有多种，主要有肺炎克雷伯氏菌、梭状芽孢杆菌等［９　们。本　研究以克雷伯氏杆菌（Ｋ０）为原始菌株，建立了用高效液相色谱法（ＩｔＰＬＣ）检测克雷伯杆菌发酵液中　１，３～ＰＤ含量的方法，对克雷伯杆菌进行多轮紫外诱变，以期筛选出能够耐较高浓度甘油的高产１，３一ＰＤ　的变异菌株，并对其遗传稳定性进行考察，获得１株可作为１，３一ＰＤ生产工艺研究的出发菌株。现将研　究结果报告如下：　１材料与方法　１．１材料与仪器　１．１．１茵种克雷伯杆菌　ｉｅＵａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＤＳＭ　２０２６，编号Ｋ０。　１．１．２培养基ＬＢ培养基、种子培养基、发酵培养基、平板培养基（发酵培养基＋加１％琼脂，甘油浓度　６０—９０ｇ／Ｌ）㈨。　１．１．３仪器超声波细胞破碎仪ＵＰ　５０Ｈ、高速冷冻离心机３Ｋ３０、４Ｋ１５超速低温冷冻离心机、Ａｇｉｌｅｎｔ　１　１００高效液相色谱仪［美国安捷仑公司，包括四元梯度泵、手动进样器、柱温箱、示差折光检测器、在线真　空脱气机、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎｓ色谱工作站］。　１．２方法　１．２．１游离细胞发酵５Ｌ发酵罐中装入３Ｌ种子培养基，接入一２０￣Ｃ保存在ＬＢ培养基中的克雷伯杆菌　菌体进行活化，然后取２ｍＬ活化后的克雷伯杆菌菌液接入装有５０ｍＬ发酵培养基的２５０ｍＬ的三角瓶中，　２８￣Ｃ，２００ｒ／ｍｉｎ，摇床培养２４ｈ，低温下６　５００ｒ／ｍｉｎ高速冷冻离心３０ｍｉｎ，收集菌体与上清液。菌体用含　２ｍｍｏｌ／Ｌ二硫苏糖醇的＂Ｉｉｒｓ—ＨＣｌ（ｐＨ值８．４）缓冲液一２０￣Ｃ条件下保存备用，上清液作为检测样品。　１．２．２标准样品与发酵液色谱行为测定上清液样品的预处理：２ｍＬ检测样品在１３　Ｏ００ｒ／ｍｉｎ，３０ｍｉｎ离心　后取上清液用水膜过滤３遍。参考文献［５］的方法，选择高效液相色谱条件：色谱柱为Ａｍｉｎｅｘ　ＨＰＸ一８７Ｈ离　子交换柱，柱温４ｏｏＣ；检测器为光示差检测器，温度为室温；流动相为３５％乙氰，６５％水，０．００５ｍｏｌ／Ｌ　Ｈ２ＳＯ　，　流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ，进样量２０ｗＬ。配制３一ＨＰＡ、ＤＨＡ、Ｇｌｙ与１，３一ＰＤ标准液在相同条件下进行色谱行为　分析。　１．２．３耐高浓度甘油茵株诱变选育　１．２．３．１紫外诱变处理将ｌｍＬ，一２Ｏ℃保存的原始菌株液接入５０ｍＬ种子培养基中，３７￣Ｃ，２５Ｏｆ／ｒａｉｎ培养　２４ｈ，用去离子水稀释至１Ｏ。个・ｍＬ～；然后用紫外线进行照射诱变，逐一取已稀释的１５ｍＬ菌液于无菌的直径　为９ｃｍ平皿内，磁力搅拌器搅拌，同时用功率为３０Ｗ紫外灯，在距离菌液面３４ｃｍ处，分别照射０．５、１、２，４、６、　８、１Ｏ、１２　ｍｉｎ，然后将每份照射菌液分别稀释１Ｏ～一１Ｏ－５倍（即稀释度分别为１Ｏ～一１Ｏ　），待用。　１．２．３．２　目的突变菌株的筛选将上述紫外照射后的菌液，分别取稀释度为ｌＯ～、ｌＯ一、ｌＯ　的稀释菌液　各０．１ｍＬ涂布装有固体培养基的筛选平板，３７￣Ｃ培养２４ｈ后作菌落计数，并计算不同照射时间的致死率。　致死率＝（１—３１／Ｎｏ）×１００％，其中：Ⅳ为经紫外线照射后平板上的菌落；Ⅳ０为对照平板上菌落数（即未诱　变）。将每轮筛选得到的菌株接入发酵培养基中，３７℃，２００ｒ／ｒａｉｎ振荡培养２４ｈ，测定残余甘油含量和　１，３一ＰＤ生成量，从中筛选２—３株１，３一ＰＤ产量较高的变异菌株，再接人种子培养基中３７℃培养２４ｈ，进　行下一轮诱变。第１轮诱变挑选出的菌株编号为　一１—３，第２轮诱变筛选出的菌株编号为ＫⅡ一１—３；　同时每轮逐步提高筛选平板培养基中的甘油浓度（从６Ｏｇ／Ｌ提高至９Ｏｇ／Ｌ），连续诱变筛选６轮。　２结果与分析　２．１标准样品与游离细胞发酵样品的高效液相色谱行为测定　通过比较分析可知，只有ＨＰＬＣ才有可能同时测定Ｇｌｙ、１，３一ＰＤ、３一ＨＰＡ、ＤＨＡ这４种物质。　为了标定各组分出峰时间，配制３一ＨＰＡ、ＤＨＡ、Ｇｌｙ与１，３一ＰＤ标准液进行色谱行为分析，然后在相　同色谱条件下将获得的样品色谱图与标准液色谱图进行对照，根据出峰保留时间比照确定样品液中各组　分。应用外标法（标样与样品进样量相同）制作浓度与峰面积关系的标准曲线计算各组分含量。由于　维普资讯 http://www.cqvip.com

１３６　山地农业生物学报　２００８年　３一ＨＰＡ没有纯品，因此用发酵得到的３一ＨＰＡ替代，对进行定性分析（一定浓度范围内，浓度与峰面积之　间存在线性关系，通过峰面积的变化来表征３一ＨＰＡ的浓度变化）。仪器系统运行稳定后，在选定的色谱　条件下，用微量进样器分别取２０　Ｌ混合标准品和样品进行检测，获得标准样品与发酵液样品高效液相色　谱如图ｌ（Ａ）、（Ｂ）所示。　从图ｌ（Ａ）可见，在标准样品的ＨＰＬＣ中，待分析物质在３０ｍｉｎ内达到基线分离，由图中的各物质峰可　看出，底产物３一ＨＰＡ、ＤＨＡ、Ｇｌｙ和ｌ，３一ＰＤ的各峰标准保留时间分别为８．６２４ｒａｉｎ、１８．１４４ｒａｉｎ、２０．５８１ｒａｉｎ　和２２．８９０ｒａｉｎ，这样就可以各物质标准保留时问为基准，鉴定未知物质；同时参照文献［１１］再分别配制不　同浓度的ＤＨＡ、Ｇｌｙ和ｌ，３一ＰＤ标准溶液，依同样方法进样后根据该溶液的不同浓度与相应峰面积的关　系，分别作出ＤＨＡ、Ｇｌｙ和ｌ，３一ＰＤ的标准曲线，并用软件回归出ＤＨＡ、Ｇｌｙ和ｌ，３一ＰＤ浓度与峰面积关系　的方程式；这样测定出未知样品液中各物质的峰面积便可由此方程式计算出未知样品中ＤＨＡ、Ｇｌｙ和　ｌ，３一ＰＤ的浓度。　从图ｌ（Ｂ）可见，游离细胞发酵液中底产物出峰时问分别为８．６７７ｍｉｎ、１８．６０８ｒａｉｎ、２０．４７２ｒｎｉｎ　和２１．７３９ｍｉｎ，这与标准样品各底产物３一ＨＰＡ、ＤＨＡ、Ｇｌｙ和ｌ，３一ＰＤ的出峰标准保留时间基本相同。由图ｌ　（Ａ）、（Ｂ）对照可说明，应用液相色谱法同时测定发酵液中各组分含量的方法是可行的。根据峰面积与浓度　关系式，可计算得到目标产物ｌ，３一ＰＤ的含量；同时也可检测其他底产物与ｌ，３一ＰＤ产量间的关系。　Ａ　‘　壹　耋　童　置　三　旦　ＩｌＩｕＵ　曹　２ｏｏｏｏｏ　兰雪　垂　ｌ０ｏｏｏｏ　誉　舀岂　Ｏ　图１标准样品（Ａ）与游离细胞发酵液（Ｂ）的高效液相色谱图　Ｆｉｇ．１　ＨＰＬＣ　ｏｆ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓａｍｐｌｅ（Ａ）ａｎｄ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ　ｃｅｌｌ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｌｉｑｕｉｄ（Ｂ）　２．２诱变条件的确定　２．２．１　茵体诱变浓度经紫外诱变处理结果可知，１０一、ｌ０。稀释度下单菌落过于密集，难以计数，在　ｌ０　稀释度下比较合适，故诱变采用ｌ０　稀释度。　２．２．２诱变照射时间根据统计与计算结果可知，克雷伯杆菌经紫外线照射后，致死率随照射时间的增　加而明显增加，当照射时间为６ｒａｉｎ时，致死率为９０．９％，照射时间为１０ｍｉｎ时，致死率达１００％。一般认　为致死率在９０％一９５％时对菌株性状的诱变效果最好，所以采用６ｍｉｎ作为紫外诱变克雷伯杆菌的最佳作　用时间。经过紫外诱变涂布平板后，生长出的菌落为圆形、白色、表面湿润、饱满，相对于对照组菌落在形　态上没有大的变化，但是其菌落直径明显增大，是原始菌落的２—４倍。　维普资讯 http://www.cqvip.com 第２期　庄莹。等：１，３一丙二醇高产变异菌株的紫外诱变选育　１３７　２．３目的突变菌株的筛选　目的突变菌株根据测定甘油转化产物１，３一ＰＤ的含量来进行筛选。根据确定的较优紫外诱变条件　从原始菌株开始连续诱变筛选数代，在第６代诱变筛选中筛选到耐高浓度甘油（９０ｇ／Ｌ）并可高产１，３一ＰＤ　的变异菌株，将筛选出的菌落接种斜面后，分别编号为ＫＶＩ一１—３，并对其遗传性状作进一步考查。　２．４　目的菌株遗传稳定性考察结果　变异菌株传代培养时，遗传性状存在不稳定现　表１变异菌株ＫＶＩ一１遗传稳定性发酵考察结果　Ｔａｂ．１　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｍｕｔａｎ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＫＶＩ一１　象。为了考察所得到的突变菌株的遗传稳定性，将　变异菌株ＫＶＩ一１—３分别进行６代遗传稳定性考　察，每传２代进行发酵液中甘油和１，３一ＰＤ含量　的测定。通过比较，结果发现变异菌株ＫＶＩ一１具　有较好的遗传稳定性，如表１所示。　由表１可以看出，ＫＶＩ一１目的突变菌株发酵　液中经检测计算，甘油消耗率为９８％，甘油转化率　为４５％左右，说明菌株经紫外变异后能够耐较高　浓度的甘油，１，３一ＰＤ的产量也维持在４０ｇ／Ｌ左右　的水平，相比原始出发菌株的１，３一ＰＤ产量提高了３０％左右。经６代传代均能保持较为稳定的发酵水　平，说明变异菌株遗传性状较稳定，未发生回复突变等情况，可作为生产工艺研究的出发菌株。　３结论与讨论　应用高效液相色谱法同时分离了标准样品中ＤＨＡ、Ｇｌｙ与１，３一ＰＤ组分，其出峰标准时间分别为　８．６２４ｍｉｎ、１８．１４４ｍｉｎ、２０．５８１ｍｉｎ和２２．８９０ｍｉｎ；同时根据外标法建立了峰面积与各组分浓度关系的方程　式，并应用在克雷伯杆菌发酵甘油体系中底产物浓度的测定，由此建立了目标产物１，３一ＰＤ含量新的、较　为简便的测定方法。　根据诱变菌株发酵甘油产物１，３一ＰＤ的含量比较确定了较优的菌株紫外诱变条件为：紫外照射功率　３０Ｗ，照射距离３４ｃｍ，诱变菌株浓度为１０。个・ｍＬ～，适合稀释度为１０～，较优紫外照射时间为６ｍｉｎ；经　６轮紫外诱变筛选，获得１株能耐９０ｇ／Ｌ高浓度甘油的克雷伯杆菌变异菌株ＫＶＩ一１，其１，３一ＰＤ产量较　原始出发菌株提高３０％左右；经６代传代，诱变菌株ＫＶＩ一１的１，３一ＰＤ产量稳定在４０ｇ／Ｌ左右，说明所　获得的变异菌株具有一定的遗传稳定性，可作为１，３一ＰＤ生产工艺研究的出发菌株。为了提高产物　１，３一ＰＤ的产量，也可进一步采用转基因表达方法，将变异菌株中甘油代谢途径的相关催化酶的表达基因　转入大肠杆菌中，构建相应基因工程菌以实现１，３一ＰＤ的工程菌转化。　参考文献：　［１］咖Ｕ，ＭＵＬＬＥＲ　Ｒ　Ｊ，ＡＵＧＵＳＴＡ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ。Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ａｎｄ　ｂｉｏｄｅ￣ｄａｈｉｌｌｔｙ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓｅｔｅｒｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎｌ，３一ｐ￣ｏｐｏｎｅｄｉｏｌ［Ｊ］．　Ｍａｋｒｏｍｏｌ　Ｃｈｅｍ　Ｐｈｙｓ，１９９４，１９５：７９３－８０２。　［２］薛丽梅，王徘，韩大维，等．１，３一丙二醇的化学合成法［Ｊ］。化学与粘合，２０００（１）：２８—３１．　［３］李吉春，赵旭涛．１，３一丙二醇的合成方法及技术进展［Ｊ］．石化技术与应用，２００４，２２（１）：４—１１．　［４］刘兆庆，张学娟，王曙文．１，３一丙二醇的工业应用及生产方法［Ｊ］．农产品加工，２００４（２）：２６—２７．　［５］邵敬伟，刘长江。１，３一丙二醇发酵生产的研究进展［Ｊ］．沈阳农业大学学报，２００１，３２（１）：５７—６０。　［６］李琛，孙金风，诸葛健．产１，３一丙二醇菌株的筛选、改良及发酵［Ｊ］。无锡轻工大学学报，２００４，２３（１）：７１—７４．　［７］修志龙．１，３一丙二醇的微生物法生产分析［Ｊ］．现代化工，１９９９（３）：３３—３５．　［８］赵红英，张健，刘宏娟，等．１，３一丙二醇发酵过程中底物抑制及其对策的研究［Ｊ］．现代化工，２００２，２２（７）：３４—３８．　［９］ＷＥＴＨＭＡＲ　Ｍ，ＤＥＣＫＷＥＲ　Ｗ　Ｄ．Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｅｅｔｏｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｇｌｕｅｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ［Ｊ］。Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９９，１３：２８３－２８７．　［１Ｏ］郭立群。生物法合成１，３一ＰＤ［Ｊ］．精细与专用化学品，２００１，２４：２５—２８．　［１１］陈宏文．生物法合成１，３一丙二醇的过程工程研究［Ｄ］．天津：天津大学化工学院，２００５．