植物组织培养实验指导

植物组织培养实验指导

2014.3

附录 培养基母液的配制（实验老师准备）

一、实验目的：掌握培养基母液配制的方法。

二、实验原理：配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。以MS培养基为例，所需配制的母液可分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机化合物母液等。另外，还要配制生长物质母液，在不同类型的培养基中使用。 三、实验器具与药品：

电子分析天平、托盘天平、烧杯（50ml, 100ml, 500ml, 1000ml）、量筒（1000ml,100ml, 25ml）、容量瓶（1000ml,500ml,100ml）、药勺、称量纸、玻璃棒、滴管、电炉、冰箱。

配制MS培养基所需药品按培养基的配方准备。植物生长调节物质，2,4-D, NAA, 6-BA等。

四、培养基母液的配制过程

首先，按下表“MS培养基母液的配制”，将各种母液根据各自的扩大倍数，计算出扩大后的称取量，然后，分别进行药品称取和母液配制。 母液种类 成分 规定用扩大 称取量母液定配1LMS量ml/L 倍数 mg 容体积 培养基吸 ml 大量元素 KNO3 NH4NO3 MgSO4·7H2O KH2PO4 CaCl2·2H2O 4H2O 微量元素 MnSO4·ZnSO4·7H2O H3BO3 1900 1650 370 170 440 22.3 8.6 6.2 20 38000 33000 7400 3400 8800 22300 8600 1000 1 1000 取量ml 50 1000 6200 2

KI Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O 铁盐 Na-EDTA FeSO4·7H2O 维生素和烟酸 氨基酸 甘氨酸 Vit.B1 Vit.B6 肌醇 0.83 0.25 0.025 0.025 37.3 27.8 0.5 2.0 0.1 0.5 100 100 830 250 25 25 3730 2780 25 100 100 5 25 5000 1000 1000 10 10 （1） MS大量元素母液的配制

按照MS培养基配方的用量扩大20倍，将大量元素配制成20倍的母液。配制时先用量筒量取蒸馏水800ml，放入1000ml的烧杯中，依次分别称取KNO3 38g; NH4NO3 33g, MgSO4·7H2O 7.4g, KH2PO4 3.4g, CaCl2·2H2O 8.8g，按顺序先后倒入烧杯中，用玻璃棒搅动，待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液倒入1000ml的容量瓶，用蒸馏水定容至1000ml,然后，倒入细口磨砂试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于4℃冰箱保存备用。配制培养基时每升MS培养基吸取该母液量为50ml。 （2） MS微量元素母液的配制

将MS培养基配方中微量元素的无机盐用量分别扩大1000倍，用电子天平分别依次称取MnSO4·4H2O 22.3g， ZnSO4·7H2O 8.6g , H3BO3 6.2g，KI 0.83g，Na2MoO4·2H2O 0.25g，CuSO4·5H2O 0.025g，CoCl2·6H2O 0.025g，并用重蒸水逐个溶解，待全部溶解用容量瓶定容后，装入1000ml倒入细口磨砂试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于4℃冰箱保存备用。配制培养基时每升MS培养基吸取该母液量为1ml。 ( 3 ) 铁盐母液的配制

在电子天平上准确称量2.78g硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)和3.73g乙二胺四乙酸钠(Na-EDTA),分别倒入盛有400ml蒸馏水的烧杯中，微加热并不断搅拌使之全部溶

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解。将两种溶液倒入同一个1000ml的容量瓶中，混合均匀后，用蒸馏水定容至1000ml，并倒入棕色磨口试剂瓶中，经室温放置一段时间令其充分反应后，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于4℃冰箱保存备用。如果将新配制的铁盐母液立即放入冰箱中。则会容易形成沉淀。配制培养基时，每配制1000mlMS培养基吸取此母液10ml。 ( 4 )MS有机母液的配制

用电子天平依次称取：肌醇（环己六醇）5000mg，盐酸硫胺素（维生素B1）5mg，烟酸25mg，甘氨酸100mg，盐酸吡哆醇（维生素B6）25mg，用蒸馏水依次溶解并定容后，装入500ml的磨口瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名，置于4℃冰箱保存备用。配制培养基时，每配制1LMS培养基吸取该母液10ml。

（5）植物生长物质母液的配制

⑪ 2,4-D母液：准确称量2,4-D 50mg，先用1~3ml90%乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容；也可以用少量碱（如1mol/氢氧化钾、氢氧化钠）溶液，使之中和成为钠盐或钾盐，在水中溶解，再加水定容至100ml，即配成浓度为500ml/L的母液。贴上标签，注明名称、浓度和配制日期，放入4℃冰箱保存。NAA母液的配制过程与2,4-D相同。

⑫6-BA母液：准确称量50mg 6-BA，加入少量碱溶液（如1mol/氢氧化钾、氢氧化钠）或稀碱液（1mol/L盐酸）溶液使之完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即配制成浓度为500mg/L的6-BA的母液。转入磨口试剂瓶中，并贴上标签，注明母液名称、浓度和配制日期，放入4℃冰箱保存备用。 五、注意事项

在配制大量元素母液时，混合、溶解各种无机盐时要注意先后顺序，尽量把Ca2+，SO42-,PO43- 等离子错开分别溶解，同时稀释浓度要大些，并要慢慢地边混合边搅拌。

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实验一 MS培养基的配制与灭菌

一、实验目的：学习用母液法配制MS培养基以及掌握培养基灭菌的方法及操作过程。

二、实验原理：组织培养所用的培养基含有植物细胞生长所必需的各类营养物质，同时也是各种细菌、真菌滋生繁殖的极好场所。因此必须对培养基进行灭菌处理，一确保无菌操作的顺利进行。 三、实验器材及试剂：

①器材：电子天平、托盘天平、烧杯（50ml, 100ml, 500ml, 1000ml）、量筒（1000ml,100ml, 25ml）药勺、称量纸、玻璃棒、移液管（10ml, 5ml, 2ml, 1ml,0.5ml,0.2ml）、电炉（1000W）、石棉网、吸耳球、酸度计或pH试纸（5.0~7.0）、三角瓶（50ml,100ml）或果酱瓶、耐高温高压的专用封口膜、线绳、冰箱、手提式消毒灭菌锅或卧式电压力灭菌锅

②试剂：蔗糖、琼脂、活性炭、1M HCl、1M NaOH；2,4-D、6BA等植物激素母液及MS基本培养基母液。 四、实验步骤 （1）培养基的配方

本次实验分成三组，每组配制一种培养基，各组所配制的培养基如下： A 胡萝卜块根愈伤组织诱导培养基：

MS+2,4-D（1mg/L）+蔗糖（30g/L）+琼脂（8g/L） pH6.0

配制1-1.5L用小果酱瓶分装30-35瓶，另：需要无菌水每人两瓶（大果酱瓶）、纱布5块、碟子每人一个（30-35个），用报纸包好一同灭菌。 B 香蕉芽的继代生芽培养基：

MS+6BA（5mg/L）+IBA（0.1mg/L）+蔗糖（30g/L）+琼脂（8g/L） pH6.0 配制2-2.5L用小果酱瓶分装60-65瓶，即每人两瓶，另：需要纱布5块、碟子每人一个（30-35个），用报纸包好一同灭菌。 C 香蕉芽苗的生根培养基：

1/2MS+蔗糖（30g/L）+琼脂（8g/L）+活性炭（1g/L）pH6.0

配制1.5L用大果酱瓶分装30-35瓶，另外：纱布5块，碟子每人一个（30-35个），用报纸包好一同灭菌。

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（2）培养基的配制

① 称取母液：首先，将所需的各贮存母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿，量筒、烧杯、移液管、玻璃棒等放在相应的位置。然后，根据所需配制的培养基用量，按照下面的公式及所需的各种母液的扩大倍数，分别计算需吸取各母液的数量（ml）。吸取量=需要配制培养基的体积×需要配制浓度/母液浓度

② 培养基定容：取1L大烧杯一只，用量筒或移液管分别吸取各母液（注：各母液移液管不能混用）。倒入500ml蒸馏水，然后准确称量琼脂及蔗糖，最后定容至1L。

③ 调节pH值：用1mol/LHCl或1mol/LNaOH将培养基pH值调节至5.8~6.0。用酸碱调节pH值时，应用玻璃棒不断搅拌后，再用pH试纸或pH计测试培养基的pH值。然后放在电炉或微波炉内煮沸，待琼脂完全溶化。

④ 分装：将培养基分装入相应的果酱瓶中，每瓶大约20~30ml，盖上盖子，贴上标签。用记号笔注明培养基名称、配制时间及配制者姓名，待灭菌用。 ⑤ 培养基的灭菌：把分装好的培养基及其他需灭菌的各种器具和蒸馏水等，放入灭菌锅的消毒桶中，放入锅中。 （3） 培养基的灭菌步骤：

利用卧式高压灭菌锅的灭菌步骤，整个过程大概需要2个小时，按以下步骤操作： ①设定压力为0.11Mpa，温度为121℃ ②三开（开出气阀、进水阀、外红阀）

③注水（开水龙头）至离进水显示柱高端1cm左右 ④三关（关出气阀、进水阀、外红阀） ⑤打开电源开关，通电

⑥夹层压力在0.1Mpa以下可以将培养基和无菌水等需要灭菌的物品放入灭菌室⑦夹层压力达到0.1Mpa时打开夹层与灭菌室的开关

⑧夹层与灭菌室同事升温升压，如停止不升温可以手动打开放气阀再放气3~5分钟，待冷空气全部排净就可以升温升压，待达到0.1Mpa、121℃时，灭菌锅会自动保温不会继续升温与升压，这时开始计时15~20分钟，（培养基灭菌需要15~20分钟、无菌水需要20~30分钟）

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⑨时间到，关闭电源，可以慢慢打开出气阀放气

⑩待温度与压力下降，80℃以下时可以将培养基与无菌水等移出灭菌锅备用 五 实验结果：一周后观察试验结果，描述培养基是否凝固及状态、颜色，如果实验失败（培养基不凝固）请分析原因，并自己找时间重新配置。 六 思考题：

1.培养基配置过程中应注意哪些因素？培养基为什么要煮沸后再分装？ 2.调节pH值应该调高0.2-0.3个单位，为什么？

3.什么因素影响培养基的凝固？灭菌锅的应用应该注意哪些方面？

实验二 外植体的消毒及其愈伤组织的诱导

一、实验目的：通过实验，初步掌握外植体材料的消毒、接种的无菌操作技术以及外植体愈伤组织的诱导方法。

二、实验原理：植物组织培养是应用无菌操作的方法培养离体植物器官或组织、甚至单个细胞的过程，如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料去进行组织培养，这是取得组织培养成功的最基本的前提和保证。由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，通过脱分化，形成一种能迅速增值的无特定结构和功能的细胞团—愈伤组织，而植物生长调节剂2,4-D是诱导外植体形成愈伤组织的重要影响因素，本实验采用MS培养基添加2,4-D来诱导胡萝卜的愈伤组织。 三、实验材料、试剂及器具 ①材料： 新鲜的胡萝卜块根

②试剂及培养基：0.1%HgCl2（剧毒！小心使用） 、75%乙醇、无菌水 胡萝卜块根愈伤组织诱导的培养基：

MS+2,4-D（1mg/L）+蔗糖（30g/L）+琼脂（8g/L） pH5.8-6.0

③器具：超净工作台、酒精灯、烧杯、镊子、剪刀、解剖刀、无菌水吸水纸、标签纸、记号笔 四、实验步骤：

①接种前，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯，照射约20~30min，然后开送风开关，之后关闭紫外灯，通风10min后，在打开日关灯。用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，点燃酒精灯，镊子和解剖刀在酒

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精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后即可进行外植体的消毒和接种。

②将胡萝卜块根在自来水下冲洗干净，用解剖刀切去外围组织，切成小块分别置于100ml烧杯中，用75%酒精浸泡30S后，移入0.1%氯化汞溶液浸泡10min，然后在超净台内用无菌水冲洗4次，沥干水后，置于灭菌处理过的碟子中，用灼烧后的镊子和解剖刀将胡萝卜形成层部分横纵切成0.5cm2的小块。以上操作都要在酒精灯火焰旁进行。

③在酒精灯旁打开培养基瓶盖，用无菌的镊子，将胡萝卜髓部组织小块接种在培养基中，每瓶接种3~4块，封口后，熄灭酒精灯，瓶上贴上标签，注明姓名、接种日期及材料名称。

④将上述接种有胡萝卜块根的外植体培养瓶置于实验室的培养室内进行培养。并整理超净工作台台面。

五、实验结果及分析：1周后观察是否污染，2~3周后观察愈伤组织生长情况并进行简单讨论分析。 六、思考题：

1.在接种过程中，通过哪些措施来防止杂菌对接种工具、接种材料的污染？ 2.胡萝卜切块灭菌后为什么要反复清洗？在接种时为什么一定要切割胡萝卜块的外围？切割多大接种才最合适？被接种的部位一定要含有哪种组织，为什么？

实验三 香蕉的继代生芽培养

一、实验目的：学习根据不同的培养目的选择不同的培养基的原理及常规无菌操作方法。

二、实验原理：根据细胞分裂素和生长素的不同比例决定细胞分化方向的原理，利用细胞分裂素比例高于生长素则促进生芽的原理进行香蕉的生芽培养。 三、实验器材与试剂：

①器材：超净工作台、酒精灯、碟子、镊子、剪刀、解剖刀、标签纸、记号笔 ②试剂：75%乙醇

③香蕉芽的继代生芽培养基：

MS+6BA（5mg/L）+IBA（0.1mg/L）+蔗糖（30g/L）+琼脂（8g/L） pH5.8-6.0 四、实验步骤：

①接种前，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯，

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照射约20~30min，然后开送风开关，之后关闭紫外灯，通风10min后，在打开日关灯。用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，点燃酒精灯，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后即可进行香蕉继代生芽接种。

②在酒精灯火焰旁打开香蕉芽的果酱瓶，用灼烧过的镊子取出3-5簇芽苗，放在灭过菌的碟子上，用解剖刀把每簇芽苗切成分别含有2-3个芽苗的小簇苗，然后再切去芽的尖端。

③用镊子将切好的芽苗插入继代培养基中，每瓶接种3-4个去掉芽顶端的小簇苗。封口后，熄灭酒精灯，瓶上贴上标签，注明姓名、接种日期及材料名称。 ④将上述接种的继代香蕉芽置于实验室的培养室内进行光照培养，并整理超净工作台台面。

五、实验结果及分析：一周后观察实验结果并在实验报告上详细写出观察结果并简单分析。 六、思考题：

1.香蕉芽苗的继代培养基配方为什么加入6BA和IBA？

2.接种时为什么要切除顶芽，为什么要2～3个小芽苗一起接种？

实验四 香蕉芽苗的诱导生根

一、实验目的：学习选用生根培养基对已经产生茎芽的植株进行诱导生根的原理及操作方法。

二、实验原理：通过在基本培养基中添加一定物质（活性碳或生长调节剂）来诱导香蕉芽生根，进而使其成为一个完整植株。 三、实验器材与试剂：

①器具：超净工作台、酒精灯、碟子、镊子、剪刀、解剖刀、标签纸、记号笔 ②75%乙醇

③香蕉芽诱导生根培养基：

1/2MS+蔗糖（30g/L）+琼脂（8g/L）+活性炭（1g/L）pH5.8-6.0 四、实验步骤：

①接种前，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯，照射约20~30min，然后开送风开关，之后关闭紫外灯，通风10min后，在打开日关灯。用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽

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烧片刻，待冷却后即可进行香蕉继代生芽接种。

②在酒精灯火焰旁打开香蕉芽的果酱瓶，用镊子取出带芽的小簇苗，放在灭过菌的碟子上，用解剖刀把每一个小芽分开。

③用镊子把每一个芽苗插入生根培养基中，每瓶可以接种3~4个芽苗。封口后，熄灭酒精灯，瓶上贴上标签，注明姓名、接种日期及材料名称。

④将上述接种的香蕉芽苗置于实验室的培养室内进行生根培养，并整理超净工作台台面。

五、实验结果及分析：2周后观察实验结果，查看香蕉芽苗的生根情况，详细记录在实验报告上并简单分析。 六、思考题：

1.香蕉芽苗的诱导生根的培养基配方为什么不加激素？培养基为什么可以用1/2MS?加入活性炭的目的是什么？

2.生根接种时，这次为什么不去除芽苗的顶端优势？

实验五、植物离体器官的快速繁殖（1）—培养基的配制

一、实验目的：通过植物离体器官的快速繁殖培养，掌握植物离体器官的快速繁殖的基本方法和过程。

二、实验原理：植物离体快速繁殖又叫微型繁殖，即把植物材料如茎尖、腋芽或叶片等放在培养容器内给予人工培养基和合适的无菌培养条件，达到短时间高速增殖植株的无性生殖技术。本次实验主要是利用母液法进行培养基的配制。 三、实验器材和试剂：

①器材：电子天平、托盘天平、烧杯（50ml, 100ml, 500ml, 1000ml）、量筒（1000ml,100ml, 25ml）药勺、称量纸、玻璃棒、移液管（10ml, 5ml, 2ml, 1ml,0.5ml,0.2ml）、电炉（1000W）、石棉网、吸耳球、酸度计或pH试纸（5.0~7.0）、三角瓶（50ml,100ml）或果酱瓶、耐高温高压的专用封口膜、线绳、冰箱、手提式消毒灭菌锅或卧式电压力灭菌锅

②试剂：蔗糖、琼脂、活性炭、1M HCl、1M NaOH；2,4-D、6BA等植物激素母液及MS基本培养基母液。 四、实验步骤： （1）培养基的配方

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本次实验自由分成若干小组，每组自己选择湛江市可以找到或买到的材料并根据自己选择的材料通过网上或相关组培书选择适合本组材料的培养基，然后通过母液法进行配制，每组大约配制0.5L培养基。 （2）培养基的配制

①首先，将所需的各贮存母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿，量筒、烧杯、移液管、玻璃棒等放在相应的位置。然后，根据所需配制的培养基用量，按照下面的公式及所需的各种母液的扩大倍数，分别计算需吸取各母液的数量（ml）。 吸取量=需要配制培养基的体积×需要配制浓度/母液浓度

② 取1L大烧杯一只，用量筒或移液管分别吸取各母液（注：各母液移液管不能混用）。倒入500ml蒸馏水，然后准确称量琼脂及蔗糖，最后定容至1L，放在电炉或微波炉内煮沸，待琼脂完全溶化。

③ 用1mol/LHCl或1mol/LNaOH将培养基pH值调节至5.8~6.0。用酸碱调节pH值时，应用玻璃棒不断搅拌后，再用pH试纸或pH计测试培养基的pH值。 ④ 将培养基分装入相应的果酱瓶中，每瓶大约20~30ml，盖上盖子，贴上标签。用记号笔注明培养基名称、配制时间及配制者姓名，待灭菌用。

⑤ 培养基的灭菌：把分装好的培养基及其他需灭菌的各种器具和蒸馏水等，放入灭菌锅的消毒桶中，放入锅中。按实验一的灭菌步骤操作。

五、 结果与分析：1周后观察培养基凝固状态及颜色，如果不成功，分析原因，自找时间重新配制。 六、思考题：

1.根据的培养基配方，说明为什么要用该种培养基，如果加了激素，为什么加入该激素，作用是什么？

2..灭菌锅灭菌过程中什么情况下应该手动放气？为什么？

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实验六、植物离体器官的快速繁殖（2）—外植体的接种

一、实验目的：通过植物离体器官的快速繁殖培养，掌握植物离体器官的快速繁殖的基本方法和过程。

二、实验原理：植物离体快速繁殖又叫微型繁殖，即把植物材料如茎尖、腋芽或叶片等放在培养容器内给予人工培养基和合适的无菌培养条件，达到短时间高速增殖植株的无性生殖技术。本次实验主要是进行外植体的接种。 三、实验器材与试剂：

①材料： 新鲜的植物材料—叶片或茎段

②试剂及培养基：0.1%HgCl2（剧毒！小心使用） 、2%次氯酸钠或10%次氯酸钙、75%乙醇、无菌水 该材料的培养基：

MS++蔗糖（30g/L）+琼脂（8g/L）+激素 pH5.8-6.0

③器具：超净工作台、酒精灯、烧杯、镊子、剪刀、解剖刀、无菌水吸水纸、标签纸、记号笔 四、实验步骤：

①接种前，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯，照射约20~30min，然后开送风开关，之后关闭紫外灯，通风10min后，在打开日关灯。用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，点燃酒精灯，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后即可进行外植体的消毒和接种。

②将植物材料的叶片或茎段在自来水下冲洗干净，用解剖刀切去外围组织，切成8~10cm小块分别置于100ml烧杯中，用75%酒精浸泡30S后，移入0.1%氯化汞溶液浸泡10min，然后在超净台内用无菌水冲洗4次，沥干水后，置于灭菌处理过的碟子中，用消毒的镊子和解剖刀将植物材料横纵切成0.5cm2的小块。以上操作都要在酒精灯火焰旁进行。

③在酒精灯旁边打开培养基瓶盖，用无菌的镊子，将材料小块接种在培养基中，每瓶接种3~4块，封口后，熄灭酒精灯，瓶上贴上标签，注明姓名、接种日期及材料名称。

④将上述接种有植物材料的外植体培养瓶置于实验室的培养室内进行培养，并整理超净工作台台面。

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五、实验结果及分析：1周后观察污染情况，2周后观察生长情况，做好实验记录详细写在实验报告上并简单分析。 六、思考题：

1.根据你的材料的接种方式,说明你为什么采用该器官进行接种？

2.你的材料灭菌后为什么还要切割？切割时每个外植体切割成多大的才最合适？

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宛淑艳 修订