协和医学杂志（增刊） ・产 科・ 诊断性二代测序指南 通过二代测序（ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ） 能够快速对某个个体患者的数千个甚至数百万个ＤＮＡ 碱基对进行测序。这一技术的快速出现并且获得成 功，预示着遗传学诊断新的时代的到来。但是，新技 术也带来了新挑战，一方面是技术层面上的，即数据 提供了潜在的全方位获益。暂时还不能将这项技术应 用于诊断的原因在于其质量较差，尚不能给病人提供 足够的验证试验，目前也不能接受其应用于临床 诊断。 声明Ｉ：根据目前的指南，ＮＧＳ尚不能应用于临 处理问题，另一方面是对结果和后续遗传咨询方面问 题的解释，而所有这些都会涉及到对ＮＧＳ在诊断方面 的精确定位问题，无论今天还是明天都是如此。在着 手购置诊断性ＮＧＳ机器以及有关技术之前尚有许多问 题需要处理。基于上述情况，诊断性ＮＧＳ指南应运而 生。该指南主要解决ＮＧＳ检测在罕见的和主要的单基 因遗传病方面的问题，集中于对基因集合的靶向分析 方面，通过特异性捕获检测或是从全外显子测序中提 取数据。原则上说，全基因组分析可能很快会被应用 以提取相类似的数据，但全外显子测序也能够检测到 疾病的其他分子特征，因此其应用会更加广泛。 有３个研讨会讨论了关于诊断｝生ＮＧＳ各个方面的 问题。第１次研讨会于２０１３年２月２５ Ｅｔ一２６日在 Ｌｅｕｖｅｎ举行，其初步观点于２０１３年３月７日～８日在 Ｐｒａｇｕｅ举办的欧洲基因检测科学大会上发布。第２次 研讨会是编辑研讨会，于２０１３年１０月１日～２日在 Ｌｅｕｖｅｎ举行，来自各个层面的人汇集在一起讨论并起 草有关文件，第１版文件于２０１３年１１月２１日～２２日 在Ｎｉｊｍｅｇｅｎ举办的第３届研讨会之前完成。最后一次 研讨会邀请了更多的利益相关者来对这个文件进行评 价并形成声明。最终的文件被提交到欧洲人类遗传学 会理事会，并于２０１５年７月１ Ｅｔ获得认可。 本文所呈现的是在撰写指南过程中出现的声明， 这个声明对指南进行了更加广泛的阐述，可以作为指 南的补充材料。这个补充材料同时包括了定义和一般 介绍，更重要的是，还包括了一些实际的病例和 模板。 二代测序技术发展水平 从某种意义上说，可靠的ＮＧＳ技术平台尚不稳 定，因为ＮＧＳ的技术和应用变化频繁且快速。但是， 这并不妨碍将这项技术应用于诊断，因为ＮＧＳ给病人 ４４ Ｏｃｔｏｂｅｒ．２０１６ 床实践，因为尚无一项可接受的验证试验方法。 必须事先明确诊断试验的目的是为了除外某种诊 断还是为了确认某种诊断，因为这两者之间存在显著 区别。这一区别主要取决于测试的完整性，这不但要 求有不同的设置，更重要的是对诊断的不同看法。 声明２：实验室必须明确其所提供的检测是用于 除外某种诊断，还是用于确认某种诊断。 二代测序诊断／临床应用 将ＮＧＳ应用于诊断的优势是可以在相对较短的时 间内以相对较低的费用对很多个基因进行一次性检 测，从而产生更多的分子诊断。 ＮＧＳ的局限性取决于其所采用的平台和富集方 法，要想获得高质量的诊断，在检测之前必须考虑到 这两方面的问题，因为这对富集方法、测序平台的选 择以及还需进行的额外测试均有影响。 声明３：必须在验证试验开始之前就讨论确定需 要采用哪些试验或分析方法，以及采用这些试验或分 析方法的目的，并将讨论摘要写入验证报告中。 “诊断产出”被定义为检出某种致病性变异并从 而得出分子诊断的几率，通过每个病人队列计算得 出，主要是从临床层面来评价ＮＧＳ的表现，也是评价 该检测效率及其临床应用价值的重要指标。 声明４：实验室若考虑将ＮＧＳ应用于诊断，首先 必须考虑其诊断产出。 在实践工作中，诊断试验往往倾向于提供基因集 合。当考虑实施诊断性试验时必须定义将某一个基因 纳入到集合中所需具备的条件。在理想的情况下，这 个问题应该在一个专业学会的层面上、通过多学科讨 论的方式来解决，其目的是要给所有诊断试验编撰一 个基因名单，更重要的是要协调各种遗传学检测方 法。当然，从病人和医学从业者的角度来看，能够通 协和医学杂志（增刊） 用并且获得同等价值则尤为重要。 声明５：对诊断目的而言，只有那些异常基因型 和表现型之间的关系已经明确的基因（无论是通过已 发表的论著还是通过验证）才能被纳人分析。 那些与缺陷的主要部分相关的基因被称为“核心 基因”，其敏感性不会因为从Ｓａｎｇｅｒ测序转化为ＮＧＳ 而受到影响。一个强有力的例子就是ＢＲＣＡ１和 ＢＲＣＡ２基因，通过Ｓａｎｇｅｒ测序再加上缺失／重复分析， 关的疾病。 ＮＧＳ的检测结果主要基于主动发现和次要发现的 几率，主动发现来自于和所检测疾病相关的基因中， 而次要发现来自于和所检测疾病病因不相关的疾病基 因中。 声明９：诊断实验室的分析渠道应集中在被研究 的基因集合中，以避免产生次要发现，并且进行相应 的验证。 其敏感性可以达到９９％。这一点也同样适用于其他诊 在一个基因集合中产生主动发现的几率很低，这 断产出很高的基因。增加其他基因无疑可以增加诊断 产出，但这不能以漏检为代价。因此，能够增加多少 检出率就成为确定核心基因名单的关键性决定因素。 声明６：为避免不可靠的检测并兼顾病人的利益， “核心基因名单”应由临床和实验室专家共同制定。 实验室会不考虑指南的规定而采用不同的ＮＧＳ检 测设置（技术性的和诊断性的），事实上，也确实存 在很多不适配于指南的各种情况。因此，研究者提出 ＮＧＳ诊断的评分标准，对不同的实验室进行公平打分 和简易比较。 （１）Ａ类检测：实验室可以保证＞９９％的可靠参 照要求或对不同编码区域和侧翼内含子区域的测序要 求，用Ｓａｎｇｅｒ测序方法（或其他补充测序分析方法） 来填充所有的缺口，并可以利用所采用的平台来进行 额外分析，如均聚物延伸分析。 （２）Ｂ类检测：实验室明确描述哪些区域达到 ＞９９％的可靠参照要求或其他测序要求，用Ｓａｎｇｅｒ测 序方法填充部分缺口。 （３）ｃ类检测：完全依赖于ＮＧＳ本身的质量，不 提供任何额外的Ｓａｎｇｅｒ测序或其他测序分析方法。 声明７：采用基于覆盖率和诊断产出的简单评分 标准可以对不同的实验室所提供的诊断检测进行 对比。 知情同意以及提供给病人和临床医生的信息 基于ＮＧＳ的诊断性试验的应用取决于试验步骤、 所采用的平台、滤过程序、以及实验室所采用的数据 储存方法。因此，应充分告知咨询医生这一遗传学检 测的局限性以及可能由此带来的不良后果。 声明８：实验室必须对每一次ＮＧＳ试验都提供以 下信息：靶向疾病、所检测基因的名称、已报道的检 测范围、分析的敏感性和特异性，如果可能的话，还 包括由于所检测基因的突变所导致的和临床表型不相 主要取决于所涉及的基因。但有可能会检测到隐性情 况下的杂合突变，因此而检测到携带者。这将会对遗 传咨询、生育选择等产生影响。 声明１０：实验室应提供产生主动发现的几率方面 的信息。 在实施一个基于ＮＧＳ的试验之前，临床（遗传 学）中心需要建立一个“主动发现和次要发现规范”， 该规范必须和伦理委员会的决议相一致，且必须在实 验室、研究所或国家层面上被决定。无论病人是选择 性接受还是拒绝接受在最初诊断结果以外的信息，这 个规范均应详细说明是否应报告主动发现和携带者状 态，且实验室应明确其可以管理好各种不同的意见。 声明１ １：如果一个临床中心或实验室决定给病人 提供关于选择性接受或拒绝接受不相关疾病携带者状 态和次要发现结果的选择权时，需要涵盖所有有关的 可能性。 同时，必须进行检测前遗传咨询，内容应该包括 对预期结果以及可能出现的主动发现和次要发现进行 的讨论。咨询必须提供足够多的信息。 声明ｌ２：应向病人清楚说明关于对主动发现和次 要发现的实验室政策。 声明１３：推荐通过书面的单张或在线方式向病人 提供足够的信息。 二代测序技术验证 样本的质量牵涉到很多方面的参数，例如数据的 数量、ＰＣＲ扩增及覆盖的比例。要达到诊断的目的， 则只针对高质量的样本进行分析，因此就必须确定高 质量的靶基因集合、外显子或基因组。 声明１４：所有用于诊断的关于ＮＧＳ质量的参数必 须被精确描述。 ＮＧＳ技术要求对运行、分析及样本的特异性特征 分别进行监测。监测数据不必报告但应用于持续的验 Ｖｏ１．７增刊４５ 协和医学杂志（增刊） 证中。 是需达到国家要求并符合常识。 声明２２：诊断性实验室必须采取措施以保证对所 有相关数据进行长期储存。 在进行任何分析前必须定义临床目标，即所有的 编码区域加上保守剪切位点。临床目标的确定则依据 诊断试验和限定的基因集合而定。 声明２３：在试验过程中必须确定报告的范围，即 声明１５：诊断性实验室必须针对以下三个方面建 立相关质量检测的结构性数据库：（１）检测平台； （２）所有分析；（３）所有样本。 用于ＮＧＳ工作流程的样本追踪方法非常复杂，涉 及到实验室部分和计算机分析中的多个步骤。 声明１６：对分析的评估应包括样本追踪和样本鉴 别条码设定的各个方面，也包括在平台验证的内容。 在平台验证中，实验室必须确认其所有设备和试 能够获得可靠结果的临床目标，而且必须告知临床医 生（通过报告形式或数字通讯方式）。 剂都必须满足制造商的要求。必须发现各个实验室自 身的局限性并且在检测和数据分析过程中充分考虑到 这些因素。实验室应区分这些问题是来自检测平台环 节、测试特异性环节，或数据分析环节。 声明１７：一般平台验证部分应包括准确性和精确 性验证，这一工作不必在每次测试中重复进行。 显然，每个测序技术都有其优势和劣势，生物信 息工具必须反映出这些特征。 声明１８：生物信息流程必须和所采用的技术平台 相符。 诊断特异性的验证流程必须采用分析的灵敏度和 特异度来进行评估。例如，适用于ＳＮＰ检测的计算方 法对于小的插入或缺失就不够准确。实验室必须明确 这些特征，并且充分测试各种不同的检测流程。 声明１９：必须针对分析灵敏度和分析特异度分别 建立不同的验证流程。 任何有关化学、富集步骤、生物信息学分析平台 方面的改变都必须经过重新验证。 声明２０：如果生物信息学流程（公共工具或商业 软件包）发生改变，诊断性实验室必须用标准数据集 对其进行验证。 所有相关变量的内置数据库提供了用于鉴别平台 特异性产物的工具，对验证结果进行追踪，并提供了 对位点特异性数据库和荟萃分析的互换。这一数据库 应允许进一步的注解（如假阳性、已发表的突变、分 离变量等），从而使诊断过程更加合理。 声明２１：诊断实验室必须针对现行的相关变量建 立结构数据库。 数据的储存必须坚持用标准开放式文件格式 ＦＡＳＴＱ，ＢＡＭ和ＶＣＦ，可用于和其他实验室进行数据 交换。当储存分析结果时，必须同时储存ｆｕｌｌ—ｌｏｇ文 件。１ｏｇ文件应尽可能完善，使得从ＦＡＳＴＱ数据到诊 断报告的分析都可复制。遗憾的是，目前尚无一个关 于数据储存方面的国际共识，对数据储存的普遍共识 ４６ Ｏｃｔｏｂｅｒ，２０１６ 声明２４：对“可报告范围”的要求依据分析目的 而定。例如，目的是获得高诊断产出的外显子测序就 不需要进行以获取在全基因组范围内高覆盖率为目的 额外分析，却需要和临床医生明确沟通说明，这一检 测不能用于除外某一种特定的临床诊断。 必须通过准确性、分析灵敏度、分析特异度、精 确性这些指标来评价诊断性试验的表现。原则上讲， 这些都不是新要求但却普遍被认为不易操作。但是， 针对这方面的国际化标准是非常严格的。 声明２５：无论何时对试验做出重大变更都应该检 查质量参数，必须重新检测样本。实验室应事先确定 好改进或升级方法时要对哪种类型的样本以及多少样 本量进行重新分析。 二代测序报告 ＮＧＳ的结果应以清晰的方式发放，因为读实验室 报告的人包括非专业人员。从实践的立场来说，有临 床意义的结论、相关性试验、以及试验质量数据，应 该在首页上特别标示出来。 所有病理性（５类）和可能病理性（４类）变异 都应报告。是否报告未分类变异（ＵＶｓ一３类）则根据 各实验室的实际情况而定，但实验室研究人员和临床 医生均须明确这些情况。 声明２７：实验室自身的政策必须和国际指南保持 一致，对于报告的基因变量，实验室应在对其提供分 析之前就明确界定，并记录在案。 声明２８：必须收集ＵＶｓ的数据，目的是最终对这 些变异进行明确分类。 需要一个团体来收集和共享已知的数据，目的是 最终将这些变异归类为病理性（５类）或良性 （１类）。 实验室或研究所对主动发现和次要发现所采取的 策略必须能够反映在实验室日常工作和报告中。 协和医学杂志（增刊） 声明２９：实验室应该在开始试验之前建立明确的 步骤来阐述主动发现和次要发现。 鉴于这一领域中新的发现和进展，诊断性实验室 不应由于分析“旧”数据而超负荷。实验室只提供在 现阶段已知的和已验证的结果。 声明３０：不应期待实验室去系统性重新分析旧的 数据并报告新的发现，即使当核心疾病基因集合已经 发生改变也不应如此。 从另一方面讲，在一个特定的时刻，应由这一疾 病的实验室或团体的专家来将某一变异从某一级别更 改至另一级别，实验室则应负责重新分析可靠的数 据，在新的证据基础上重新发放报告，重新联系开单 临床医生，因为病人很可能会受到该变异的新的状态 的影响。在这种情况下，应该有一个体系来将病人和 变异关联起来，当变异被重新分类之后检索受累 病例。 声明３１：为了能够管理好疾病变异，实验室应建 立自己的针对不同疾病的变异数据库。 研究和诊断的区别 随着全基因组检测用于诊断和研究的可能性逐渐 增加，诊断和研究之间的分界就逐渐模糊起来，因 此，阐述清楚对于诊断性资料、我们能做什么、应该 做什么及需要签署哪一种类型的分析特异性研究知情 同意书，都是非常重要的事情。这并不排除对诊断性 结果作进一步研究的建议，但是，在任何情况下都应 该明确区分诊断和研究。 声明３２：诊断性试验是指任何～种直接回答和病 人的医疗情况相关的临床问题的试验。 声明３３：研究性试验是指提出～个假说，其结果 可能会和该计划中入组病人之间存在有限的临床相 关性。 声明３４：诊断性试验的结果，尤其是全外显子或 全基因组分析的结果，可以产生自某个假说。 如果诊断性试验的目的是为了获得一个遗传学诊 断、且其分析仅限于那些已知和某种疾病相关的基 因，在诊断过程中采用获自ＮＧＳ的外显子或基因组数 据是可以被接受的。 声明３５：如果诊断性试验的主要目的是给某一个 病人作出诊断，那么该试验应该在认证实验室进行。 当病人及其家属参加某一个研究计划时，他们必 须要明确这样的计划可能会获得和某种遗传性疾病相 关的诊断或预测性信息。在研究中，临床相关性的结 果只能在获得诊断性试验确认之后才能发送至病人的 医疗记录中。 声明３６：在将研究性结果发送给病人之前必须在 认证实验室确认该结果。 为了使对变异的解释更加容易，大多数实验室会 给所有在自己实验室进行测序／分析的样本（理想的 情况是有健康的父母）的变异频率建立数据库。这样 的数据库不包括任何敏感信息，基于隐私规则的考虑 也不权衡这些数据对提高诊断水平和改善健康保健的 重要性。 声明３７：所有在诊断性或研究性试验中获得的健 康个体的变异频率都应被分享。 在理想的情况下，所有检测到的和疾病相关的基 因变异都应该发送到病理性变异的数据库中，并且将 其与病人的临床资料相关联，同时也要明确描述变异 分类的标准和争议。 声明３８：所有报道的变异都应该发送至联邦、地 区、国家、和／或国际数据库中共享。 参考文献 ［１］Ｍａｔｔｈｉｊｓ Ｇ，Ｓｏｕｃｈｅ Ｅ，Ａｌｄｅｒｓ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｄｉａｇ． ｎｏｓｔｉｃ ｎｅｘｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．Ｅｕｒｏ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ， ２０１６，２４：２－５． （戚庆炜编译） Ｖｏｌ ７增刊４７