人纤维蛋白体外降解方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110684817 A(43)申请公布日 2020.01.14

(21)申请号 201911011555.5(22)申请日 2019.10.23

(71)申请人 北京赛科希德科技股份有限公司

地址 102206 北京市昌平区科学园路7号院

1号楼8层（博雅CC-11号楼）(72)发明人 丁重辉　李博华　胡晓娟　杨娟　(74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限

公司 11227

代理人 温可睿(51)Int.Cl.

C12P 21/06(2006.01)G01N 33/96(2006.01)

权利要求书1页 说明书8页 附图2页

(54)发明名称

人纤维蛋白体外降解方法(57)摘要

本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及人纤维蛋白体外降解方法。本发明对纤维蛋白采用过滤研磨的方式进行前处理，将制备的纤维蛋白在机械剪切力的作用下形成均一，细小的颗粒状，方便后续纤溶酶的降解。并且通过控制加入纤溶酶的量，以及在纤溶结束后，迅速离心获得上清后，通过添加一定量的冻干配方，制成冻干品可以长期稳定保存1年以上。另外经实验证实，本发明方案中的参数下能够获得更稳定的降解产物，相对于其他参数具有更明显的优势。

CN 110684817 ACN 110684817 A

权　利　要　求　书

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1.人纤维蛋白体外降解方法，包括：将人纤维蛋白以Tris缓冲液重悬，搅拌10～20min后，弃除液体进行研磨；所述研磨的产物以Tris降解缓冲液重悬，加入纤溶酶，37℃，100rpm摇床酶解；所述酶解的产物经4000rpm离心30min取上清，与2×冻干缓冲液混合，进行赋值后冻干，制得人纤维蛋白降解产物；

所述Tris降解缓冲液包括：50mM Tris-HCl，0.9％的NaCl，0.1％苯甲酸钠，pH值为8.5；所述2×冻干缓冲液包括：Hepes 4wt％、海藻糖1g/L、牛白蛋白70g/L、甘露醇40g/L、苯甲酸钠0.2wt％，pH值为7.6～7.8；

所述冻干的程序为：0～3h，20℃→-50℃；3h～4h，保持-50℃；4h～6h，-50℃→-25℃；6h～12h，保持-25℃；12h～16h，-25℃→0℃；16h～17h，0℃→25℃；25℃保持。

2.根据权利要求1所述的降解方法，其特征在于，所述人纤维蛋白的制备方法为：将血浆与等体积25mM的CaCl2溶液混合，然后加入凝血酶至浓度为2～3U/mL，混匀后37℃放置30min获得交联纤维蛋白，以Tris降解缓冲液清洗后，获得人纤维蛋白。

3.根据权利要求1所述的降解方法，其特征在于，所述搅拌的时间为15min，转速为100～200rpm；所述研磨的条件为时间为10～20min，研磨至乳胶状。4.根据权利要求1所述的降解方法，其特征在于，所述研磨的产物以Tris降解缓冲液重悬至研磨产物的质量分数为1％。

5.根据权利要求1所述的降解方法，其特征在于，每克研磨产物加入纤溶酶的量为3.6U。

6.根据权利要求5所述的降解方法，其特征在于，所述纤溶酶以生理盐水配制成浓度为150U/mL。

7.根据权利要求1所述的降解方法，其特征在于，所述上清与2×冻干缓冲液混合的体积比为1：1。

8.根据权利要求1所述的降解方法，其特征在于，所述赋值前与2×冻干混合液混合的液体于-20℃冻存，赋值前于37℃复溶。

9.根据权利要求1所述的降解方法，其特征在于，所述赋值包括以1×冻干混合液调整FDP或D-dimer的浓度；

FDP质控I赋值为4～6μg/mL，质控II赋值为20～30μg/mL；D-dimer质控I赋值为0.4～0.6μg/mL，质控II赋值为2.8～3.5μg/mL；所述1×冻干缓冲液包括：Hepes 2wt％、海藻糖0.5g/L、牛白蛋白35g/L、甘露醇20g/L、苯甲酸钠0.1wt％，pH值为7.6～7.8。

10.权利要求1～9任一项所述的降解方法制得的降解产物在制备试剂盒中质控品和/或校准品中的应用；或在制备抗原免疫或筛选相应的抗体中的应用。

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人纤维蛋白体外降解方法

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技术领域

[0001]本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及人纤维蛋白体外降解方法。

背景技术

[0002]纤维蛋白溶解系统简称纤溶系统，是指纤溶酶原在纤溶酶作用下转变为纤溶酶。纤溶系统主要包括纤溶激活物，抑制物和纤溶蛋白构成。在体内纤溶系统的激活主要包括三条途径，即内激活途径，外激活途径和外源激活途径，内激活主要由内源凝血系统的有关因子启动，因子XIIa，XIa，高分子量激肽原HMWK，激肽释放酶参与，是继发性纤溶的理论基础；外激活主要是组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和尿激型纤溶酶原激活物(u-PA)作用的，同时二者又受纤溶酶原激活物抑制物(PAI)的抑制，构成原发性纤溶的理论基础。外源激活途径是指向体内注入纤溶激活物链激酶(SK)，尿激酶(UK)，重组t-PA等实现栓溶的目的，是栓溶治疗的理论基础。

[0003]纤维蛋白作为凝血瀑布启动后产生的止血血块，机体形成后会激活纤溶系统所产生的纤溶酶对其进行降解从而达到溶栓的过程。D-二聚体和纤维蛋白(原)降解产物(FDP)测定试剂盒可以对纤维蛋白或者纤维蛋白原降解产物进行测定。[0004]FDP和D-二聚体检测在临床应用上非常广泛，对于VTE的阴性排除，DIC的辅助诊断，恶性肿瘤，白血病以及各类原发性和继发性纤溶亢进的诊断，栓溶后的药物实验室检测都可以通过FDP和D-二聚体的指标来判断。[0005]而现有技术中，大多分别制备FDP和D-二聚体来制备试剂盒，这种方法比较复杂。而少量的关于同时制备FDP和D-二聚体，并用于检测，但所得的FDP和D-二聚体纯度和稳定性都存在一定的问题，无法作为质控品或标准品。

[0006]纤溶酶作用于纤维蛋白原后的早期分解产物为X片段，随后X片段进一步降解为Y片段和D片段，Y片段进一步降解为E片段和D片段，最终纤维蛋白原在纤溶酶的作用降解为E片段和D片段。纤溶酶作用于交联的纤维蛋白时，最终产物包含了D-二聚体，XDP，D片段和E片段等混合物，其中D-二聚体由两个D片段和一个E片段构成，XDP是高分子片段由多聚体构成。

[0007]纤维蛋白(原)降解产物检测，主要是针对发生纤溶后的一些列产物进行测定，主要包括D-二聚体，XDP，X，Y等片段。通过乳胶免疫比浊法测定，在乳胶颗粒上包被好可以检测相应的FDP和D-二聚体的单克隆抗体，利用抗原抗体结合后阻挡光路，通过检测光浊度的变化，和预先设好的定标曲线来定量检测FDP和D二聚体的含量。发明内容

[0008]有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供人纤维蛋白体外降解方法。该方法获得的D-二聚体和FDP品质优良，能够作为质控品和校准品，也可以作为抗原免疫或筛选相应的抗体。

[0009]本发明提供了人纤维蛋白体外降解方法，包括：

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将人纤维蛋白以Tris缓冲液重悬，搅拌10～20min后，弃除液体进行研磨；

[0011]所述研磨的产物以Tris降解缓冲液重悬，加入纤溶酶，37℃，100rpm摇床酶解；[0012]所述酶解的产物经4000rpm离心30min取上清，与2×冻干缓冲液混合，进行赋值后冻干，制得人纤维蛋白降解产物；[0013]所述Tris降解缓冲液包括：50mM Tris-HCl，0.9％的NaCl，0.1％苯甲酸钠，pH值为8.5；

[0014]所述2×冻干缓冲液包括：Hepes 4wt％、海藻糖1g/L、牛白蛋白70g/L、甘露醇40g/L、苯甲酸钠0.2wt％，pH值为7.6～7.8；[0015]所述冻干的程序为：0～3h，20℃→-50℃；3h～4h，保持-50℃；4h～6h，-50℃→-25℃；6h～12h，保持-25℃；12h～16h，-25℃→0℃；16h～17h，0℃→25℃；25℃保持。[0016]本发明中，所述人纤维蛋白的制备方法为：[0017]将血浆与等体积25mM的CaCl2溶液混合，然后加入凝血酶至浓度为2～3U/mL，混匀后37℃放置30min获得交联纤维蛋白，以Tris降解缓冲液清洗后，获得人纤维蛋白。[0018]本发明中，所述搅拌的时间为15min，转速为100rpm；所述研磨的时间为10-20min，研磨至乳胶状。

[0019]本发明的制备方法中采用研磨的方式对纤维蛋白进行破碎，使得碎片更充分，更易降解。

[0020]本发明中，所述研磨的产物以Tris降解缓冲液重悬至研磨产物的质量分数为1％。[0021]本发明中，每克研磨产物加入纤溶酶的量为3.6U。[0022]本发明通过直接添加纤溶酶来降解纤维蛋白，避免了更多杂蛋白的引入。并且，本发明停止酶解反应是通过添加冻干缓冲液来抑制酶活性，避免了高温对纤维蛋白稳定性的影响。

[0023]本发明实施例中，所述纤溶酶以生理盐水配制成浓度为150U/mL。[0024]本发明中，所述上清与冻干缓冲液混合的体积比为1：1。[0025]本发明中，所述赋值前与冻干混合液混合的液体于-20℃冻存，赋值前于37℃复溶。

[0026]所述赋值包括以1×冻干混合液调整FDP或D-dimer的浓度。[0027]本发明中，FDP质控I赋值为4～6μg/mL，质控II赋值为20～30μg/mL；[0028]D-dimer质控I赋值为0.4～0.6μg/mL，质控II赋值为2.8～3.5μg/mL。[0029]所述1×冻干缓冲液包括：Hepes 2wt％、海藻糖0.5g/L、牛白蛋白35g/L、甘露醇20g/L、苯甲酸钠0.1wt％，pH值为7.6～7.8。

[0030]本发明所述的降解方法制得的降解产物在制备试剂盒中质控品和/或校准品中的应用；或在制备抗原免疫或筛选相应的抗体中的应用。

[0031]本发明对纤维蛋白采用过滤研磨的方式进行前处理，将制备的纤维蛋白在机械剪切力的作用下形成均一，细小的颗粒状，方便后续纤溶酶的降解。并且通过控制加入纤溶酶的量，以及在纤溶结束后，迅速离心获得上清后，通过添加一定量的冻干配方，制成冻干品可以长期稳定保存1年以上。另外经实验证实，本发明方案中的参数下能够获得更稳定的降解产物，相对于其他参数具有更明显的优势。

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附图说明

[0032]图1示D-二聚体定标曲线；[0033]图2示FDP定标曲线；[0034]图3示冻干曲线；[0035]图4示纯化效果。

具体实施方式

[0036]本发明提供了人纤维蛋白体外降解方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。[0037]本发明采用的仪器和试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。[0038]下面结合实施例，进一步阐述本发明：[0039]实施例1制备工艺筛选[0040]1、原材料准备及配制[0041]1.1、三羟甲基氨基甲烷(Tris)氯化钠降解缓冲液：50mM Tris-HCl，0.9％的生理盐水，0.1％苯甲酸钠，pH 8.5。[0042]1.2、2×冻干缓冲液：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)4％，海藻糖1g/L，牛白蛋白70g/L，甘露醇40g/L，苯甲酸钠0.2wt％，pH 7.6-7.8；[0043]1×冻干缓冲液：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)2％，海藻糖0.5g/L，牛白蛋白35g/L，甘露醇20g/L，苯甲酸钠0.1wt％，pH 7.6-7.8；[0044]1.3、氯化钙(CaCl2)溶液：25mM的CaCl2溶液。[0045]1.4、纤溶酶：Sigma购买的纤溶酶，纯水复溶，分装冻在-20℃冰箱保存。[0046]1.5、凝血酶：溶于生理盐水中配制成120U/ml。每次添加凝血酶最终浓度达到2-3U/mL。

[0047]1.6、血浆：按照1:1的比例和CaCl2溶液混合均匀。[0048]2、制备过程

[0049]2.1降解原料制备：[0050]制备三种原料，分析降解效果：[0051]2.1.1血浆中提取交联纤维蛋白[0052]①血浆在水浴锅中完全融化，水浴锅温度设定38.5℃[0053]②将溶解好的血浆按照1:1加入CaCl2溶液，混合均匀上下颠倒数次。[0054]③加配制好的凝血酶加入血浆中使得最终浓度2-3U/mL，轻轻的上下混匀产生絮状沉淀后再放入37℃水浴锅内放置30min。

[0055]④将交联纤维蛋白除去多余的血浆后，再用Tris降解缓冲液多次清洗过滤。[0056]2.1.2纤维蛋白原[0057]2.1.3冷沉淀：冷沉淀制备方法：从-80℃冰箱中拿出血浆放入4℃中过夜，次日拿出会析出纤维蛋白原，离心得到沉淀后，再以生理盐水重悬溶解得到冷沉淀。

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⑤用Tris缓冲液搅拌剪碎的纤维蛋白15min，用吸水纸吸干多余液体后称重，剪

碎，研磨。

[0059]2.2纤维蛋白降解

[0060]2.2.1以纤溶酶降解：沉淀加入40mL的Tris降解缓冲液，配制成纤维蛋白质量百分数为1％的溶液，加一定量纤溶酶37℃摇床100rpm降解。1g纤维蛋白加纤溶酶24μL，纤溶酶配制成150U/mL。

[0061]2.2.2以尿激酶降解：沉淀加入40mL的Tris降解缓冲液，配制成纤维蛋白质量百分数为1％的溶液，加一定量尿激酶37℃摇床100rpm降解。1g纤维蛋白加尿激酶24μL，尿激酶配制成150U/mL。

[0062]2.3纤维蛋白降解产物的保存[0063]2.3.1上述降解产物用4000rpm，30min离心取上清，所得上清液，按照上述2倍冻干液配方1:1混合放在-20℃冰箱保存。

[0064]2.3.2高温56℃处理1～3小时终止反应，放在-20℃冰箱保存。[0065]3、不同制备过程及方法得到的结果如下：[0066]3.1、原材料选择问题材料纤维蛋白原冷沉淀血浆中提取交联纤维蛋白

FDP检测值40μg/ml5μg/ml>80μg/ml

[0068]结论：使用不同的原材料作为降解初始底物，纤维蛋白原，冷沉淀和血浆中提取的交联纤维蛋白检测FDP值，血浆中提取的交联纤维蛋白FDP值明显高于其他两个。[0069]3.2、原材料处理的选择[0070]在2.2中，选择使用研钵研磨或不使用研钵研磨，检测降解结果。

[0071][0067]

[0072]

结论：使用研磨后更易降解，而未研磨的大块纤维蛋白，在降解时无法降解到一定的高值。

[0074]3.3、纤溶过程的选择[0075]在步骤2.3中，在纤溶酶降解时，选择添加或不添加纤溶酶激活剂尿激酶，观察降解效果。

不同激活剂FDP检测值纤溶酶降解>80μg/ml尿激酶降解30μg/ml

[0077]结论：直接添加纤溶酶开始降解相较于通过添加尿激酶激活纤溶酶原而再进一步形成纤溶酶更易控制。添加尿激酶会受到血浆本身纤溶酶原的含量，而直接添加纤溶酶不受影响。若血浆纤溶酶原含量少则无法降解出高浓度的降解产物。[0078]3.4、稳定性问题

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处理后，样品于4℃放置，检查样品中FDP含量。

[0080]56℃处理后，放置4℃观察，1小时监测FDP含量为37.35μg/ml，2h后检测FDP含量为22.19μg/ml，3h后FDP含量为12.54μg/ml，高温并无法抑制纤溶酶活性，高温处理后样品中FDP仍不断降解。

[0081]添加2倍冻干液后，放置4℃观察，稀释后24小时监测25.25为μg/ml，三天后检测24.96μg/ml，一周后检测24.75μg/ml，稳定性大大提高[0082]结论：通过提高温度不能很好的破坏纤溶酶的活性，降解产物稳定性无法保证，故而采用的添加冻干保护剂来抑制纤溶酶活性[0083]实施例2

[0084]根据实施例1的结果，选择如下步骤进行降解：[0085]1、原材料准备及配制

[0086]1.1三羟甲基氨基甲烷(Tris)氯化钠降解缓冲液：50mM Tris-HCl，0.9％的生理盐水，0.1％苯甲酸钠，pH 8.5。[0087]1.2 2×冻干缓冲液：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)4％，海藻糖1g/L，牛白蛋白70g/L，甘露醇40g/L，苯甲酸钠0.2wt％，pH 7.6-7.8；[0088]1×冻干缓冲液：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)2％，海藻糖0.5g/L，牛白蛋白35g/L，甘露醇20g/L，苯甲酸钠0.1wt％，pH 7.6-7.8；[0089]1.3氯化钙(CaCl2)溶液：25mM的CaCl2溶液。[0090]1.4纤溶酶：Sigma购买的纤溶酶，纯水复溶，分装冻在-20℃冰箱保存。[0091]1.5凝血酶：溶于生理盐水中配制成120U/ml。每次添加凝血酶最终浓度达到2-3U/mL。

[0092]1.6血浆：按照1:1的比例和CaCl2溶液混合均匀。[0093]2、制备过程

[0094]2.1纤维蛋白的制备

[0095]①血浆在水浴锅中完全融化，水浴锅温度设定38.5℃[0096]②将溶解好的血浆按照1:1加入CaCl2溶液，混合均匀上下颠倒数次。[0097]③加配制好的凝血酶加入血浆中使得最终浓度2-3U/mL，轻轻的上下混匀产生絮状沉淀后再放入37℃水浴锅内放置30min。

[0098]④将交联纤维蛋白除去多余的血浆后，再用Tris降解缓冲液多次清洗过滤。[0099]⑤用Tris缓冲液搅拌剪碎的纤维蛋白15min，用吸水纸吸干多余液体后称重，剪碎，研磨。

[0100]2.2纤维蛋白降解

[0101]沉淀加入40mL的Tris降解缓冲液，配制成纤维蛋白质量百分数为1％的溶液，加一定量纤溶酶37℃摇床100rpm降解。1g纤维蛋白加纤溶酶24μL，纤溶酶配制成150mU/mL。(150U/mL)

[0102]2.3纤维蛋白降解产物的保存

[0103]一定浓度的纤维蛋白降解产物用4000rpm，30min离心取上清。[0104]将离心后的上清液，与上述2×冻干缓冲液等体积混合放在-20℃冰箱保存。[0105]2.4FDP质控品赋值

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按照图1～2所示定标曲线进行质控品赋值，赋值采用1×冻干缓冲液FDP质控I在

4-6μg/mL之间，质控II在20-30μg/mL之间。D-dimer质控I在0.4-0.6μg/mL，质控II在2.8-3.5μg/mL之间。

[0107]2.5质控品冻干

[0108]从-20℃冰箱中放在37℃烘箱中迅速复溶，使用冻干缓冲液稀释至相应倍数。按照冻干规程分装1mL补加0.1mL，分装在每个硅化瓶中进行冻干。

[0109]冷冻干燥(简称冻干)是指将含有大量水分的溶液试剂在低温下冻结成固体，然后在真空条件下使水蒸汽直接从固体中升华出来，而物质本身留在冻结的冰架中，因此它干燥后体积不变、疏松多孔。整个干燥过程是在较低温度下进行的，这样干燥后的试剂，其物理、化学和形状基本不变，有效成分损失极小，复水性好，密封保存周期长。对于1.1ml的D-dimer和FDP质控品和校准品冻干曲线采用图3所示曲线进行[0110]3、性能评价

[0111]对提取所得产物的如下指标进行检测，结果如表1：[0112]3.1、瓶间差：一批试剂随机选取10瓶进行测定[0113]3.2、批间差：选取5批随机一瓶试剂进行检测[0114]3.3、重复性：同一瓶试剂连续测定5次[0115]3.4、稳定性：37℃放置8h测定加速稳定性[0116]3.5、开瓶稳定性：2-8℃开瓶放置7天测定开瓶稳定性[0117]3.6、长期稳定性：-20℃冰箱放置12个月，测定长期稳定性：[0118]表1检测结果

[0119]

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[0120]

[0121]

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上述结果表明，本发明提供方法制得的裂解产物具有良好的稳定性和重复性，且

瓶间差、批间差皆较小。[0123]4、纤维蛋白降解产物的纯化[0124]采用分子筛G200进行纯化，平衡缓冲液为Tris-HCl，纯化结果如图4：使用GE的AKTA蛋白纯化仪将降解好的纤维蛋白进行蛋白纯化，图4中前5个峰为分子筛的Marker，后3个峰为上样的结果，分别为分子量大于699kd的高分子片段，200kd左右的二聚体片段和50kd的小分子片段，纯度良好，各个片段使用蛋白胶回收试剂盒可以作为相应抗体的免疫原和筛选原的制备。

[0125]以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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图1

图2

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说　明　书　附　图

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图3

图4

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