维普资讯 http://www.cqvip.com 第２１卷第６期 无锡轻工大学学报 Ｖｏ１．２ｌ Ｎｏ ６ ２００２年１１月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｗｕｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ＮＯＶ． ２００２ 文章编号：１００９—０３８Ｘ（２００２ Ｊ０６—０５９７—０５ 丁酸菌的分离、鉴定及筛选 赵建新， 张灏， 田丰伟 （江南大学食品学院，江苏无锡２１４０３６） 摘 要：从３２位健康人的粪便中分离到４株丁酸梭状芽抱杆菌，其中丁酸梭状芽抱杆菌ｚ．１０产 酸和细胞生长速度最快，对其安全性评价为基本无毒，并进行了鉴定． 关键词：丁酸梭状芽孢杆菌；分离；鉴定；筛选 中图分类号：Ｑ ９３—３３１ 文献标识码：Ａ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＺＨＡＯ Ｊｉａｎ—ｘｉｎ， ＺＨＡＮＧ Ｈａｏ，ＴＩＡＮ Ｆｅｎｇ—ｗｅｉ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４０３６，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｏｕｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｅｃｅｓ ｏｆ ３２ ｎｏｒｍａｌ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ，ａ— ｍｏｎｇ ｗｈｉｃｈ ｓｔｒａｉｎ Ｚ一１ ０ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｓｐｅｅｄ ｏｆ ａｃｉｄ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ．Ｔｈｅ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｚ一１０ ｗａｓ ｂａｓｉｃａｌｌｙ ｎｏｎｐｏｉｓｏｎｏｕｓ， Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ 丁酸梭状芽孢杆菌（Ｃｌｏｓｔ，．ｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕ ）又 哚类物质的产生ｎ ；（２）在肠道内产生维生素Ｂ族、 名酪酸菌，主要存在于奶酪、天然酸奶、人与动物粪 维生素Ｋ、淀粉酶，有良好的保健作用；（３）代谢物 便、某些树叶、土壤等自然环境中，一般在１０％～ 丁酸是肠上皮组织细胞再生和修复的主要营养物 ２０％健康人群中能分离得到…，丁酸梭状芽孢杆菌 质；（４）对多种抗生素有较强的耐受性，与抗生素并 作为微生态制剂来研究，是１９３３年由日本干叶医 用时不会影响其生物作用，并能大幅度降低伪膜性 科大学宫入近治首先发现并报告，因此又名宫入 肠炎的发病率【８ ；（５）在人体内不受胃酸、消化酶、 菌【２］．其作为微生态制剂的药理机制至今还没有得 胆汁酸等影响．作者从健康人群粪便中分离筛选出 到清楚的解释【３ Ｊ．丁酸梭状芽孢杆菌活菌制剂经日 生长性状较优良的丁酸梭状芽孢杆菌，并进行了菌 本学者的大量研究证明，主要在大肠和盲肠周边增 种鉴定．为丁酸梭状芽孢杆菌的进一步应用提供了 殖，目前广泛应用于消化、小儿、外科、肿瘤、妇产科 理论依据． 等种种原因引起的肠道菌群失调，急慢性腹泻，肠 易激综合症，抗生素相关性肠炎，便秘或腹泻便秘 １材料与方法 交替症等疾病的治疗【４・ ．６］．作为微生态制剂有如下 １．１实验材料 特点：（１）促进肠道内有益菌群的增殖和发育，抑制 １．１．１样品采集选择不同鲢康人群的粪便作为 肠道内有害菌和腐败菌的生长繁殖。减少胺类、吲 样品来源． 收稿日期：２００２—０５—２０；修订日期：２００２—０９—０７． 作者简介：赵建新（１９７１一），男．河南三门峡人．工学硕士，工程师 维普资讯 http://www.cqvip.com ５９８ １．１．２培养基 无锡轻工大 学 学报 第２１卷 将菌株经液体培养，４ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心，生理盐 水洗３次，对离心得到的湿菌体称重，按国标规定 方法进行灌胃． １．２．５生理生化试验及糖类发酵试验参见参考 文献［１１］ 梭菌增殖培养基（均为质量浓度ｇ／ｄＬ）：胰蛋白 胨２．牛肉浸膏１，酵母膏０．６，葡萄糖０．４，牛胆酸盐 ０．５，复合盐１份（Ｋ２ＨＰｏ４ ０．２、ＫＨ２Ｐｏ４ ０．１、 ＭｇＳ０４ ０．０４、ＣａＣｌ２ ０．０２、ＦｅＳＯ４ ０．０１、盐酸半胱氨 酸０．０５，以下同）；ｐＨ ７．２，１２１℃，１５ ｍｌｎ杀菌． 梭菌计数培养基（均为质量浓度ｇ／ｄＩ ）：胰蛋白 胨１．牛肉浸膏０．５，酵母膏０．３，葡萄糖０．４，琼脂 １．６；复合盐１份；ｐＨ ７．２，１５ ｍｌｎ杀菌． ２结果与讨论 丁酸梭状芽孢杆菌广泛存在于自然界中，作为 梭菌分离培养基：在增殖培养基中加入：牛胆 酸盐０．５ ｇ／ｄＩ ，琼脂１．６ ｇ／ｄＬ；调ｐＨ到７．２，１５ ｍｌｎ 杀菌． 梭菌培养基：在梭菌增殖培养基中减掉牛胆酸 盐，其它成分不变，ｐＨ依试验需要用ＮａＯＨ调节， １５ ｍｉｎ杀菌． 产酸指示培养基：在梭菌培养基中加入３ ｍＩ 质量浓度为０．４ ｇ／ｄＬ的溴甲酚紫． 明胶液化培养基：在梭菌培养基中加入１．２ ｇ／ｄＩ 的明胶即可． 无碳基础培养基（均为质量浓度ｇ／ｄＩ ）：酵母膏 ０．１，（ＮＨ４）Ｓ０４ ０．２，碳源另加０．５；复合盐１份． ’ １．２实验方法 １．２．１分离方法 １）取粪便样品ｌｏ ｇ加到９０ ｍＬ稀释液中，放 入８０℃水浴１０ ｍｉｎ，杀死非芽孢菌，然后放入增殖 培养基，于３１℃培养３６ ｈ． ２）将样品分别稀释到１０一、１０一、１０＿ ，涂布 于梭菌分离培养基，放入厌氧罐中，置换３次气体 （体积分数分别为１０％的Ｈ２、１０％ｃｃｈ和８０％ Ｎ２），并用铂粒作为催化剂，在０．０１ ＭＰａ的气体压 力下３７℃厌氧培养【引３６￣４８ ｈ． ３）采用影印平板法分离菌种【加】，分别进行好 氧和厌氧培养，选取厌氧生长良好的菌株，镜检． １．２．２属及群的初步鉴定： 按＜伯杰氏细菌鉴定 手册＞ ３ 和＜细菌属的鉴定指导＞ 。１ 对分离到的纯菌 ‘株进行属的相关试验，以及群、种的相关生理生化 实验，分别包括：明胶液化试验，蜜二糖、松三糖、淀 粉水解试验． １．２．３ 菌种的产酸及最大活菌量试验接体积分 数为２％的菌种到产酸指示培养基，３７℃条件下， 厌氧培养不同时间．培养时记录指示剂变色时间， 培养变色后，用计数培养基进行菌落计数（ｃｆｕ）． １．２．４安全性评价方法 给药途径：霍恩氏法——经口（灌胃）； 急性毒理试验法——ＧＢ１５１９３—９４【１２］． 整肠剂使用，必须具有以下特点：（１）必须来源于人 体，只有这样才能最大限度在人的肠道中定植；（２） 菌株对人体的消化道环境有明显的适应性，即能在 高酸度的胃液环境和高胆汁的小肠中存活．因此选 择健康人群的粪便作为该菌的来源，采用选择性培 养基从中分离．对分离得到的菌株进行筛选和安全 性评价，得到活力较高且安全并具有生产前景的菌 株，进而研究其形态特征、生长特性． ２．１菌种分离的理论依据 丁酸梭状芽孢杆菌为典型的严格厌氧菌，直或 微弯的杆菌，产芽孢，孢子卵圆，偏心到次端生，无 孢子外壁和附属丝，（０．６～１．２），ｕｍ×（３．０～７，０） ｍ（宽×长），端圆，单个或成对，短链，偶见长丝状 菌体，以周生鞭毛运动，革兰氏阳性菌，在培养后期 能变为阴性菌．依据这些特点，设计这样的筛选分 离方法：（１）对样品进行热处理，基本杀死非芽孢 菌；（２）涂布平板，初步得到纯菌株；（３）影印好氧与 厌氧培养，除去好氧和兼性厌氧菌，得到严格厌氧 菌；（４）镜检得到典型的Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属．依据（ｔｌｆ杰 氏细菌手册），从菌落形态及个体形态以及严格厌 氧型能鉴定到属．对所得到的菌株进行明胶液化试 验及芽孢位置染色试验，可以鉴定到群．在群内只 要进行蜜二糖、松三糖、淀粉利用试验，即可鉴定到 种． ２．２菌种分离结果 采样来源见表１．对３２个样品处理培养后，共 得到菌株９３０个，以影印平板进行厌氧和好氧培 养．得到严格厌氧菌２６２个．镜检得到典型的 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ“ｍ属２１个菌株．对这２ｌ株进一步纯化后 进行个体形态、菌落特征观察，结果见表２和表３． 按＜伯杰氏细菌手册＞，对这２１株菌种进行属 到群的鉴定，对于符合群特征的菌株进行群内的初 步生理生化实验，对结果不符合要求的不再进行下 一步实验．对于可能存在不确定结果的继续进行下 一步实验，对得到的１０株菌种进一步进行糖醇类 发酵实验．得到４株丁酸梭状芽孢杆菌．结果见 维普资讯 http://www.cqvip.com 第６期 赵建新等：丁酸菌的分离、鉴定及筛选 ５９９ 表４． 表１采样来源表 ２．３菌种产酸及最大活菌量实验 Ｔａｂ．１ Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｓａｍｐｌｉｎｇ 以菌株最大的产酸能力及最多的活菌量作为 目标，可采用ｐＨ指示剂的变色和活菌计数来简化 筛选．试验结果见表５．可以看出，Ｚ一１０株有较好的 产酸能力和最多的活菌数．因此选择Ｚ一１０株作为优 选菌株． 表２分离菌种的个体形态 Ｔａｂ．２ Ｃｅｌｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ － 维普资讯 http://www.cqvip.com ６００ 无锡轻 工 大 学 学 报 第２１卷 表４群内及种的鉴别实验结果 Ｔａｂ．４ Ｉｄｅｎｔｉｌｙｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｇｒｏｕｐ 妻 编号 位置 明胶 … 一竺 蜜二糖 松三糖 淀粉 要 ～ … 编号 位置 明胶 … …竺 蜜二糖 松ｊ糖 淀粉 ～ 一… Ｚ一５ 次端生 ＋。 ｚ一３２ 次端生 ＋ Ｚ－７ 次端生 一 一 一 一 ｚ一４２ 次端生 一 ＋ 一 ＋ ｚ一１０ 次端生 ． ＋ 一 ＋ ｚ一４３ 端生 一 ｚ一１５ 次端生 一 ＋ ＋ 一 ｚ一５０ 次端生 ＋ ｚ一１９ 次端生 ＋ ｚ一５２ 端生 ＋ ｚ一２１ 端生 一 ｚ一６０ 次端生 一 一 ＋ ｚ一２２ 次端生 一 ＋ ＋ 一 ｚ一６３ 次端生 一 ＋ ＋ 一 ｚ一２４ 端生 一。 ｚ一６４ 端生 一 ｚ一２６ 端生 一。 ｚ一６５ 次端生 一 ＋ 一 ＋ ｚ一２８ 次端生 一 ＋ 一 ＋ ｚ一７０ 次端生 一 一 一 ＋ ｚ一３０ 端生 ＋ 注：“＋”实验结果阳性．“一”实验结果阴性，“＊”表示前一试验结果与要求特性不符，不再继续进行下一步实验 表５产酸及最大活菌量实验结果 ２．４安全性评价 Ｔａｂ．５ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｃｉｄ ａｎｄ ｍａｘｉｍｕｍ 按我国卫生部１９８５年颁发的＜食品安全性毒 ａｃｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎ 理学评价程序（试行）＞的规定，丁酸梭状芽孢杆菌 作为一种保健食品必须进行安全性毒理学评价试 验．第一步是急性毒性试验，半致死量Ｉ Ｄ 。是在一 定条件下衡量物质毒性大小的基本数据【ｌ ３１．用湿菌 体进行灌胃后，小鼠一直活泼，无异常及死亡现象， 说明ｚ．１０株的经口ＬＤ５０＞１０ ｇ／ｋｇ．由中药类急性 维普资讯 http://www.cqvip.com 第６期 赵建新等：丁酸菌的分离、鉴定及筛选 ６０１ 毒性试验分级标准可以认定属基本无毒【１４ Ｊ． 表６菌株ｚ．１０对碳源的同化 ２．５丁酸梭状芽孢杆菌ｚ．１Ｏ菌种的鉴定 Ｔａｂ．６ Ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｂｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕ・ ２．５．１ 细胞形态将菌种接入液体培养基，于３７ ｔｙｒｉｃｕｍ Ｚ－ＩＯ ℃厌氧培养１２ ｈ，取出，涂片、染色，进行显微摄影． 碳源 结果 碳源 结果 碳源 结果 菌株ｚ一１０为梭状，芽孢卵圆，（０．６～１．１） ｍ×（４． 苦杏仁苷 ｗ 菊糖 ＋ 水杨苷 ＋ ０～７．Ｏ） ｍ，其形态见图１． 阿拉伯糖 ｗ 乳糖 ＋ 山梨醇 ． 纤维二糖 ＋ 麦芽糖 ＋ 山梨糖 一 卫矛醇 甘露糖 ＋ 淀粉 ＋ 七叶苷 Ｗ 甘露醇 ＋ 蔗糖 ＋ 果糖 ＋ 松三糖 ． 海藻糖 ＋ 半乳糖 ＋ 密二糖 ＋ 木糖 ＋ 葡萄糖 ＋ 棉子糖 ＋ 核糖醇 ． １Ｏ００ｘ 甘油 ＋ 鼠李糖 ｗ 纤维素 ． 图１丁酸梭状芽孢杆菌Ｚ．１０的菌体形态 糖原 ＋ 核糖 ＋ 赤藓糖醇 ． Ｆｉｇ．１ Ｃｅｌｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｚ－ＩＯ 肌醇 ｗ ２．５．２ 培养特征将菌种接入液体培养基，于 ３７℃厌氧培养．培养初期试管上部轻微浑浊，符合 注：“＋”试验结果阳性，“一”试验结果阴性，“ｗ”表示试验 结果不明显． 严格厌氧菌的特征．培养初期产大量气，后期沉淀 较多．在产气旺盛期，将密封培养的试管在酒精灯 表７菌株Ｚ－ＩＯ的其它生理试验结果 Ｔａｂ．７ Ｏｔｈｅｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕ・ 旁打开。有明显的“突”声，可能是生长产生的氢气 ｔｙｒｉｃｕｍ Ｚ－ＩＯ 所致．将菌种在平板划线，于３１℃厌氧培养２４ ｈ， 其菌落如图２所示．菌落大小约１．２～３ ｍｍ，正面 实验项目 结果 实验项目 结果 为圆形，边缘整齐，侧面低凸，表面湿润光滑，乳黄 过氧化氢酶试验 ． 水解明胶试验 ． 色，不透明，略有酸臭味．其形态如图２所示． 硝酸盐还原试验 ＋ 水解酪蛋白试验 ． 吲哚试验 ． 运动性试验 ＋ 乙酰甲基甲醇试验 ． 注：“＋”试验结果阳性，“一”试验结果阴性 ３ 结 论 从健康人群的粪便分离到９３０株菌种，从９３０ 图２丁酸梭状芽孢杆菌ｚ．１０的菌落形态 株中经影印平板严格厌氧实验筛选到２６２株，对 Ｆｉｇ．２ Ｃｏｌｏｎｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ２６２株镜检得到符合梭菌属的特征菌株２１株，对２１ ｌ０ 株进行个体形态和菌落形态观察及属内群、种的研 ２．５．３生理生化特征采用＜细菌属的鉴定指导＞ 究，得到符合梭菌属群（Ｉ）特征菌株１０株，经部分 中介绍的方法，测定Ｚ．１０对各种碳源的利用情况以 生理生化实验得到４株丁酸梭状芽孢杆菌，进行发 及进行其它生理生化试验，结果见表６，表７．根据试 酵能力试验，选出产酸和菌体生长速度较快的Ｚ．１０ 验结果，对照＜伯杰氏细菌鉴定手册＞和＜细菌属的 株．对Ｚ一１０株进行安全性评价得出基本无毒．说明 鉴定指导＞检索，菌株Ｚ １０初步鉴定结果为丁酸梭 丁酸梭状芽孢杆菌Ｚ一１０株可以用于制造丁酸梭状 状芽孢杆菌． 芽孢杆菌微生态制剂． （下转第６１２页） 维普资讯 http://www.cqvip.com ６１２ 无锡轻工大 学 学报 第２１卷 ［儿］刘忠洲．微滤超滤过程中的膜污染与清洗［Ｊ］．水处理技术，１９９７，２３（４）：１８７． ［１２］杨严俊．免疫活性蛋白～鸡蛋免疫球蛋白和乳铁蛋白的研究与开发［Ｄ］．无锡：无锡轻工大学．１９９７． ［１３］赵玉萍，张灏，杨严俊．溶菌酶测定方法的改进［Ｊ］．食品科技，２００２，（１）：５８—５９． ［１４］中山大学生物系生化微生物教研室．生化技术导论［Ｍ］．北京：人民教育出版社，１９７８． ［１５］郭尧君．蛋白质电泳实验技术［Ｍ］．北京：科学出版社，１９９９． ［１６］史景江，马熙中．色谱分析法［Ｍ］．重庆：重庆大学出版社，１９９４． ［１７］潘永康，王喜忠．现代干燥技术［Ｍ］．北京：化学工业出版社，１９９８． ［１８］ＧＨＯＳＨ Ｒ．ＣＵＩ ｚ Ｆ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ Ｕｓｉｎｇ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ［Ｍ］．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，２０００ （责任编辑：杨萌） （上接第６０１页） 参考文献： ［１］ＢＥＮＮＯ Ｙ，ＳＡＷＡ Ｋ，ＭＩＴＳＵＯＫＡ Ｔ．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｍｆｌｏｒａ ｏｆ ｉｎｆａｎｔｓ：ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｃａｌ ｆｌｏｒａ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｆｅｄ ａｎｄ ｂｏｔｔｌｅ． ｆｅｄ ｉｎｆａｎｔｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｌｍｍｕｎｏｌ，１９８４，２８：９７５—９８６． ［２］ＦＵＪＩＴＡ Ｉ，ＭＡＥＤＡ Ａ，ＴＡＫＡＳＨＩＫ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｔｉ．ｄｉａｒｒｈｅａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ０ｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｍｉｙａｉｒｉ ＩＩ ５８８［Ｊ］．Ｊｐｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ，１９８６，１４：６０７３—６０８０． ［３］ＳＡＴＯ Ｒ，ＴＡＮＡＫＡ Ｍ．Ｉｎｔｓｅｔｉｎａｌ Ｄｉｓｔｉｒｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｒｌａｕｍｉｎａｌ Ｌｏｃｌａｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｌａｌｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｉｎ Ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９７，４１（９）：６６５—６７１． ［４］ＦＵＪＩＴＡ Ｉ，ＴＡＫＡＳＨＩ Ｋ．Ｓｔｕｄｉｓｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｔｉ—ｄｉａｒｒｈｅａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｍｉｙａｉｒｉ ５８８［Ｊ］．Ｊｐｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ，１９８６，１４：１３７—１４１． ［５］ＫＵＲＯＩＷＡ Ｔ．ＫＯＢＴＩ Ｋ，ＩＷＡＮＧＡ Ｍ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｔｅｍｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｂｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＭＩＹＡＩＲＩ ５８８［Ｊ］．Ｊ Ｊｐｎ Ａ ｌｎｆ ｄ，１９９０．６４：２５７—２６３． ［６］ＯＫＡＭＯＴＯ Ｔ．ＳＡＳＫＩ Ｍ，ＡＲＡＫＩ Ｙ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｏｒａ１．ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ［Ｊ］．Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ａｂｓｏｒｐ，１９９６，１９：６５—６８． ［７］ＫＵＲＯＩＷＡ Ｔ，ＩＷＡＮＡＧＡ Ｍ，ＫＯＢＡＲＩ Ｋ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｍ５８８ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｆｏ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｉｃｉｌｅ ｄｕｒｉｎｇ ａｎｔｉｍｉｃｍｂｉｌａ ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｊ Ｊｐｎ Ａ Ｉｎｆ Ｄ．１９９０，６４：１４２５—１４３２． ［８］ＴＡＧＵＣＨＩ Ｎ．ＡＢＥ Ｆ，ＭＩＫＡＭＩ Ｙ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｌａ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉａｒｒｈｅａ ｂｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ［Ｊ］． Ｊｐｎ Ｊ Ｂａｃｔｅｒ｜ｏ，１９８８，４３：８２９—８３５． ［９］张灏．两歧双歧杆菌在酸乳中的应用和探讨［Ｄ］．无锡：无锡轻工业学院，１９８６． ［１０］诸葛健，王正祥．工业微生物实验手册［Ｍ］．北京：中国轻工出版社，１９９４． ［儿］［澳］ｖ．Ｂ．Ｄ．斯克尔曼．细菌属的鉴定指导［Ｍ］．蔡妙英译．北京：科学出版社，１９７８． ［１２］ＧＢ１５１９３．３—９４．食品安全性毒理学评价程序和方法［Ｓ］． ［１３］＜食品卫生学）编写组编．食品卫生学［Ｍ］．北京：中国轻工出版社，１９９１． ［１４］李建华．中药类急性毒性技术法与ＬＤ５０值的分级［Ｊ］．中草药，１９９４，２５（７）：３８８—３８９． （责任编辑：杨萌）